第一作者：Lei Miao, Linxian Li, Yuxuan Huang.
通訊作者：Daniel G. Anderson
通訊單位：麻省理工大學
研究亮點：
1. 在一天之內使用3-CR快速合成了包含1,000多種化合物的大型脂質庫。
2. 發現含有環狀氨基基團（特別是哌啶六元環基團）頭部結構的脂質能夠作為高效的mRNA遞送載體。
3. 環狀脂質通過STING通道激活強烈的免疫反應。
研究背景：
接種mRNA疫苗是預防和治療癌癥的一個非常有前景的策略。與DNA疫苗相反，mRNA疫苗接種可使編碼蛋白的瞬時表達，從而避免了與插入誘變相關的并發癥。mRNA疫苗可以被專門設計為編碼多種肽和蛋白質結構，從而表達整個抗原。由于主要組織相容性復合物（MHC）I類和II類呈遞的抗原表位數量較多，mRNA疫苗可能會比肽抗原疫苗誘導要強的細胞和體液反應。
在過去的十年中，許多臨床試驗都在探索mRNA疫苗的應用。然而，臨床轉譯主要受到兩個挑戰的限制：（1）mRNA的催化水解導致細胞內蛋白表達不足；（2）抗原呈遞細胞（APCs）的抗原裝載量和成熟度不足。為了提高mRNA的傳遞和體內蛋白質的表達，脂質體和基于聚合物膠束的制劑正在開發中，包括由類脂質材料制成的納米顆粒載體。
設計一種能夠平衡抗原特異性免疫細胞的成熟和激活，同時防止免疫系統的全身性激活的療法仍然具有挑戰性。越來越多的證據表明，與I型干擾素（IFNs）靶向刺激相關的佐劑效應可能更有利于適應性免疫反應。可以激活IFNs分泌的途徑包括Toll樣受體（TLR），視黃酸誘導型基因I樣受體（RLRs）和干擾素基因刺激因子（STING）。據報道，這些途徑的激活與人類癌癥患者減緩病情的進展和更好的臨床效果相關。目前，許多小分子STING激動劑正在臨床試驗中，然而，由于這些分子的胞質遞送卻受到挑戰。
成果簡介：
有鑒于此，麻省理工大學Robert Langer教授和Daniel G. Anderson教授團隊對可同時介導mRNA傳遞并通過STING途徑提供靶向佐劑刺激的脂質進行系統研究。研究團隊通過使用一步法三組分反應（3-CR）開發合成多樣性的脂質結構，并發現具有環狀氨基頭部基團的脂質可激活STING途徑。另外，將可激活STING的環狀脂質與mRNA結合以配制脂質納米顆粒（LNP），來改善細胞內在化，從而進一步改善STING途徑的細胞內激活。
圖1. 包裹mRNA的LNP的示意圖
要點1：脂質庫的設計與合成
研究人員設計了一種以異氰化物介導的一步法三組分反應（3-CR），以同時偶聯伯或仲胺、酮和異氰化物或異氰化物衍生物。合成出的脂質結構由烷基和亞烷基酮作為尾部，異氰酸酯基作為連接部和胺基作為頭組成。使用該3-CR方法簡單而快速地合成大量（1080種）且多樣的材料庫，并以此來測試mRNA的遞送效率。
圖2：脂質庫的設計與合成
要點2：脂質介導的mRNA的體內外傳遞
有效的mRNA疫苗接種既需要有效的細胞內抗原表達，又需要隨后的免疫細胞激活以產生強烈的免疫應答。研究人員首先通過將熒光素酶mRNA（mLuc）載到LNP中并比較細胞系中螢光素酶蛋白的表達來評估脂質庫的mRNA遞送功效。結果表明，LNP在BMDC，BMDM和HeLa三種細胞中的遞送效率相似，并確定A2-Iso5-2DC18和A12-Iso5-2DC18是這三種細胞類型中最有效的mRNA傳遞載體。
在體內實驗中，結果與體外數據一致，結果顯示更長的不飽和烷基尾部增強了遞送功效。再根據其異氰酸酯亞結構對2DC18脂質進行了進一步分類。結果表明，異氰基乙酸酯脂質（丁基，乙基或甲基）增強了mRNA的遞送。因此，研究人員將含有異氰基乙酸乙酯和2DC18酮的脂質定為脂質mRNA傳遞的最佳的亞結構
圖3. 脂質介導的mRNA的體內外傳遞
要點3.脂質具有不同的抗腫瘤免疫反應
緊接著，研究人員在皮下注射后測試了最佳的脂質（A2-Iso5-2DC18和A12-Iso5-2DC18，簡稱A2和A12）的疫苗接種潛力。發現載有A2和A12的mLuc LNP均可在局部注射部位和引流淋巴結中誘導蛋白質表達，并能夠轉染中央APCs細胞。然后，在測試了mRNA脂質遞送系統的適應性免疫應答和抗腫瘤功效結果中，盡管A2和A12 LNP對局部淋巴結和APCs表現出相似的mRNA遞送功效，但只有A2 LNP系統能夠誘導強烈的腫瘤免疫反應。
圖4. 脂質具有不同的抗腫瘤免疫反應
要點4：探索刺激免疫的脂質結構
研究人員由上述實驗結果探討脂質設計中的結構與功能關系，特別是研究了頭部基團的性質（雜環與線性）是否會影響脂質相關的免疫原性。研究人員用2DC18和異氰基乙酸乙酯基團生成了第二個脂質庫，但改變了胺組分以包括直鏈叔胺或雜環叔胺，來配制具有相似的粒徑、包封效率和可比的mRNA傳遞效率的LNP，并比較了mOVA疫苗接種后IFN-γ的表達，結果表明，與含有線性叔胺的脂質（線性脂質）相比，含有雜環基的脂質（環狀脂質）明顯促進了IFN-γ分泌。其他相關實驗也表明環狀脂質在刺激免疫反應上明顯優于線性脂質。
圖5. 探索刺激免疫的脂質結構
要點5：環狀脂質通過STING刺激適應性免疫細胞
前述實驗發現用A18或A21配制的第二代LNP可顯著提高遞送效率，并在幾種關鍵的免疫細胞中誘導強烈的抗原表達。研究人員繼續測試第二代LNP直接激活APC的能力，實驗表明APCs的活化不僅由mRNA觸發，而且由此類環狀脂質的獨特結構特征也能觸發。在體內實驗也觀察到類似的趨勢。
研究人員對脂質進行刺激的通道進行研究，在任何測試的模型中發現，與線性LNP均無法引發強烈的STING-I型IFN激活和APC成熟相反，環狀LNP具有特異的佐劑效應，并由STING途徑介導。
圖6.環狀脂質通過STING刺激適應性免疫細胞
要點6：環狀脂質-mRNA疫苗誘導強烈的抗腫瘤反應
研究人員最終將A18鑒定為最佳的環狀脂質。該脂質促進有效的mRNA蛋白表達，并誘導部分通過STING激活介導的強免疫應答。接下來，研究人員繼續研究環狀脂質-mRNA疫苗能否誘導強烈的抗腫瘤反應，同樣通過檢測各種表達因子，都證實這些LNP可以誘導強烈的適應性免疫應答。同時對LNP進行體內毒性檢測，這些數據進一步證明，這些環狀脂質系統可用于安全有效的抗腫瘤免疫。
圖7. 環狀脂質-mRNA疫苗誘導強烈的抗腫瘤反應
小結：
綜上所述，該項研究確定了一類可通過佐劑輔助的mRNA疫苗接種的環狀脂質，能促進了有效的mRNA傳遞和具有強烈的抗腫瘤功效。期望這些材料可以用作具有多種抗原的疫苗系統，包括腫瘤相關抗原，個性化多表位抗原以及細菌和病毒蛋白，并且可以為疫苗接種提供一種通用方法。
參考文獻：
Miao, L.; Li, L.; Huang, Y.; Delcassian, D.; Chahal, J.; Han, J.; Shi, Y.; Sadtler, K.; Gao, W.; Lin, J.; Doloff, J. C.; Langer, R.; Anderson, D. G., Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation. Nature Biotechnology 2019, 37 (10), 1174-1185.
https://doi.org/10.1038/s41587-019-0247-3
課題組介紹
Daniel G. Anderson是Samuel A. Goldblith應用生物學教授，化學工程和醫學工程與科學研究所副教授，也是麻省理工學院Koch綜合癌癥研究所的成員。他獲得了加州大學戴維斯分校的分子遺傳學博士學位。在麻省理工學院，他率先使用機器人方法來開發用于藥物輸送和醫療設備的智能生物材料。他使用的快速合成，配制，分析和對大量生物材料庫進行生物學評估的首創方法用于醫療設備，細胞療法和藥物遞送。特別是，他開發的先進的藥物輸送系統為納米顆粒藥物輸送，非病毒基因療法，siRNA輸送和疫苗提供了新方法。共發表了超過230多篇論文、專利和專利申請。這些專利已獲得制藥、化學和生物技術公司的大量許可，以及許多產品已商業化或正在臨床開發。
