第一作者：Jin Li
通訊作者：譚蔚泓、邱麗萍
通訊單位：湖南大學
研究亮點：
1. 通過自組裝構建的兩親性四面體DNA探針，可以快速高效且有方向地插到細胞膜上，且可避免細胞內化。
2. 通過調節疏水性頂點數來微調膜錨定親和力，帶有三個疏水頂點的DNA四面體可穩定地錨定在膜上。
3. 利用該納米平臺，實現了對細胞間進行特異性粘附，有效和可調節的控制，可用于進行細胞生物學方面的研究。
研究背景：
細胞間的相互作用，即細胞表面之間的直接相互作用，對于單個細胞和多細胞生物的命運和功能至關重要。相互作用特異性或相互作用強度的破壞都可能導致生物學功能障礙，甚至導致疾病進展，例如代謝異常，自身免疫性疾病和癌癥。
為了賦予細胞在相互作用時具有特定的調節作用，許多不同的功能材料，包括蛋白質，核酸，納米顆粒和聚合物，都曾在細胞表面進行過工程改造。其中，核酸具有易于合成、可預測的結構和高度可編程性的優勢，為精確控制相互作用強度和特異性提供了極好的材料。
針對核酸能在細胞表面上插入，已經開發了幾種策略，包括化學反應，代謝標記，脂質體融合和疏水性插入。盡管用膜修飾的DNA探針實現了特定的多細胞組裝，但仍有很大的改進空間。在對原始細胞狀態影響最小的情況下便捷地進行是細胞表面工程的主要的要求。由于細胞膜組合物的高度動態性質和復雜的細胞培養環境，維持DNA探針的表面呈遞仍具有挑戰性。而另一個挑戰是表面固定探針由于方向性差而導致靶向能力受到限制。
成果簡介：
有鑒于此，湖南大學邱麗萍副教授聯合譚蔚泓院士團隊通過使用DNA自組裝技術開發了一系列用于細胞表面工程的兩親性金字塔形（四面體）DNA探針，旨在構建一個有效，穩定，生物相容且通用的平臺來專門調節細胞相互作用。這些兩親性四面體通過四個DNA寡核苷酸自組裝，在一個頂點帶有一個懸垂的DNA探針，而在另一個頂點帶有膽固醇標簽。通過膽固醇與細胞磷脂層之間的疏水相互作用有效地錨定在細胞膜上。結合優異的靶標識別能力和高度多樣性的懸垂DNA探針有望為研究和操縱細胞間反應提供一種有效且可設計的納米平臺。
圖1. 兩親性DNA探針控制細胞接觸示意圖
要點1：金字塔形DNA探針的構建和表征
研究人員通過逐步添加從S1到S4的寡核苷酸來構建DNA四面體納米結構。通過凝膠遷移和AFM結果表明，約10nm大小的DNA四面體納米結構被成功構建，且該結構的形成不受膽固醇標記的影響。
接下來，研究人員繼續評估了兩親性DNA納米結構在細胞表面工程中的可行性（以T-cho3為例）。通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察到了熒光素（FAM）熒光與膜染色染料DiI熒光很好地共定位，從而驗證了T-cho3成功地修飾在膜上。此外，通過流式細胞儀實驗，觀察到了T-cho3可快速高效進行膜錨定，且篩選出250 nM的探針濃度和10分鐘的孵育時間作為后續實驗。
圖2. 金字塔形DNA探針的構建和表征
要點2：兩親金字塔形DNA探針對細胞表面修飾的能力
緊接著，研究人員對不同DNA探針的膜錨定能力進行測試。CLSM結果表明，隨著疏水性頂點數量的增加，DNA四面體的膜錨定效率明顯提高。然而，與結合有一個膽固醇標簽的線性DNA探針（S-cho1）相比，可能是由于四面體結構的位阻增加和電荷排斥導致T-cho1的膜錨定效率降低。而具有三個疏水性頂點，T-cho3表現出最強的膜錨定穩定性且可以有效減少其細胞內在化。總體而言，這些結果表明，T-cho3構建體為細胞表面工程提供了有效而可靠的平臺。
圖3. 兩親金字塔形DNA探針對細胞表面修飾的能力
要點3. 通過DNA雜交精確控制細胞間的接觸
研究人員繼續測試T-cho3操縱細胞間粘附的潛力。分別用具有懸垂DNA探針1和2的兩個不同的T-cho3修飾兩群不同細胞。在添加DNA連接體L1-2后，可觀擦到明顯的細胞組裝，且效率高達88%。同時，通過添加L1-2的完全互補DNA（cL1-2），可以容易地逆轉細胞聚集體。另外，通過比較連接體長度對細胞聚集的影響，發現長的連接體越能聚集高團簇細胞。總的來說，受益于DNA分子的高度可編程性，這種外膜錨定的納米平臺顯示出極好的調節細胞間粘附的能力。
圖4. 載藥脂肪細胞抑制腫瘤生
要點4. 基于適配體的分子識別對細胞間的精確控制
除DNA雜交外，適配體的分子識別也可實現具有靶向功能的細胞間粘附。研究人員合成了四個兩親性適配體探針。將sgc8功能化的細胞與未修飾的CEM細胞分別以1:10的比例混合。實驗結果表明T-cho2和T-cho3具有更高的膜錨定親和力，能夠實現更有效和永久的細胞結合。綜上所述，這種3D四面體支架可使識別探針具有較強的膜錨定穩定性和更高的靶標識別能力，從而為操縱細胞間粘附提供了強大的納米平臺。
圖5. 適配體的分子識別對細胞間的精確控制
要點5. 細胞間接觸觸發的細胞內信號反應
在許多情況下，細胞之間的直接物理接觸是觸發有效的細胞間傳導的關鍵初始步驟。為了測試膜錨定DNA納米平臺具有增強細胞間通訊的潛能，研究人員使用Raji B和A549兩個細胞系進行實驗?；赥-cho3介導的DNA雜交，可以將這兩種細胞系特異性組裝在一起。結果發現表明，使用當前的納米平臺操縱細胞之間的物理接觸可以調節細胞的通訊行為。而且，該平臺能構建特定模式的多細胞組裝，這為研究體外多細胞信號網絡提供有用的策略。
圖6. 細胞間接觸觸發的細胞內信號反應
小結：
綜上所述，這種3D兩親性DNA構建體為細胞表面工程提供了有效而可靠的納米平臺，通過使用這種納米平臺，實現了對細胞間粘附的特異性、有效和可調節的控制。此外，由于DNA分子的高度可編程性和高度多樣性，該納米平臺可用于研究細胞生物學的各種膜錨定操縱器/生物傳感器。
參考文獻：
Li, J.; Xun, K.; Pei, K.; Liu, X.; Peng, X.; Du, Y.; Qiu, L.; Tan, W., Cell-Membrane-Anchored DNA Nanoplatform for Programming Cellular Interactions. Journal of the American Chemical Society 2019.
https://doi.org/10.1021/jacs.9b04725
