第一作者：趙帥
通訊作者：閻錫蘊、范克龍
通訊單位：中科院生物物理研究所
研究亮點：
1. 利用Fenozyme的類過氧化氫酶的特性，清除活性氧并保護BBB免受損傷
2. 發現HFn和Fenozyme都能刺激巨噬細胞向M1型極化并增強對pRBC的吞噬作用
3. 利用Fenozyme可有效緩解在蒿甲醚治療導致的認知障礙
研究背景：
瘧疾現狀
瘧疾是由原生動物瘧原蟲引起的蚊媒傳染病，全世界每年有2億多例，且有40萬人死亡。在感染人類的5種瘧原蟲中，惡性瘧原蟲經常引起嚴重癥狀，包括威脅生命的神經系統并發癥，腦瘧疾。盡管抗瘧藥和基于青蒿素的聯合療法的開發取得了重大進展，但腦瘧疾的死亡率仍高達30％，尤其是在兒童中。此外，10-24％患腦瘧疾的兒童患者表現出神經系統后遺癥和記憶力減退，這突顯出尋找更有效和具體治療方法的重要性。
腦型瘧疾的發病機理
為了了解腦型瘧疾的發病機理，科學家們已經做出了巨大的努力。腦中感染的紅細胞在腦中累積是導致腦瘧疾的原因。這些受感染的細胞表達惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1（PfEMP1），并且可以與內皮細胞膜蛋白結合。使用實驗性腦瘧疾小鼠模型進行的研究已經證明微血管內皮細胞的損傷和血腦屏障（BBB）的破壞在腦病的發展中起著至關重要的作用。并且還有實驗已經表明從破裂的寄生蟲感染的紅細胞釋放的游離血紅素可能會產生過量的活性氧（ROS），從而損害內皮細胞并損害BBB。因此，ROS可能是在腦瘧疾發展過程中損害血腦屏障的重要介質。
鐵蛋白的應用
先前研究發現，人鐵蛋白（HFn）可以與BBB 內皮細胞（BBB ECs）上表達的HFn受體（HFRs）結合，并作為多功能納米載體用于疾病治療。且含Fe3O4的納米顆粒的納米酶具有類過氧化氫酶的活性，能有效地抑制體內ROS水平。
成果簡介：
有鑒于此，中科院生物物理研究所閻錫蘊院士和范克龍研究員團隊利用HFn蛋白為殼和Fe3O4納米酶為核組成的Fenozyme。當對患有實驗性腦瘧疾的小鼠給藥時，通過保護BBB ECs免受ROS損傷并通過使巨噬細胞極化至M1表型來降低寄生蟲血癥，Fenozyme大大提高了存活率。此外，將Fenozyme和抗瘧疾蒿甲醚聯合使用可減輕腦病和記憶障礙。結果證明了ROS在腦部瘧疾發展中的重要性，并表明將Fenozyme與抗瘧藥相結合是一種新穎的治療策略。
圖1. Fenozyme體內作用示意圖
要點1：Fenozyme保護小鼠免受實驗性腦瘧疾
研究人員通過仿生合成了H-鐵蛋白納米籠包含Fe3O4核結構的人工酶（Fenozyme）。除了具有完整結構且穩定性良好外，Fenozyme還表現出過氧化氫酶或過氧化物酶活性。然后，研究人員評估了Fenozyme對伯氏瘧原蟲ANKA寄生的紅細胞（pRBCs）的小鼠模型的影響。結果發現，經Fenozyme處理的小鼠中在第16天只有20％死亡，且可顯著提高在感染后幸存的小鼠的活動（扶正和抓地力）評分。
已知患有ECM的小鼠的死亡和異常活動是BBB破壞的結果。研究人員利用了伊文思藍檢查BBB的完整性。結果表明，用Fenozyme處理感染的小鼠后，腦部染色明顯降低，幾乎與未感染的小鼠相同。因此，Fenozymes保護BBB免受ECM誘導的損害，并且其酶活性是該保護作用所必需的。
圖2. Fenozyme保護小鼠免受實驗性腦瘧疾
要點2：Fenozyme通過清除ROS保護大腦內皮細胞
先前研究發現，HFn可以通過與HFRs結合而與BBB的內皮細胞相互作用。為了解Fenozyme保護BBB的機制， 研究人員對小鼠腦進行石蠟切片。結果表明，HFn殼可以結合HFR，并將Fenozyme定向到小鼠大腦中BBB的內皮細胞上。同時，研究人員通過熒光共定位和添加H2O2模擬氧化應激環境表明，Fenozyme通過HFRs內吞途徑進入胞質，起過氧化氫酶作用，且能夠利用類過氧化氫酶活性來保護內皮細胞免受ROS損傷。另外，Fenozyme通過清除ROS能保護BBB的完整性。
圖3. Fenozyme通過清除ROS保護大腦內皮細胞
要點3. Fenozyme通過增強巨噬細胞的增殖和吞噬作用來降低寄生蟲血病
為了充分了解Fenozyme對ECM小鼠的影響，研究人員檢查了其血液中Pb.ANKA的水平。小鼠感染pRBC后4天檢測到寄生蟲血病。而使用Fenozyme或HFn蛋白可減少寄生蟲感染的紅細胞。這可能是由于HFn作用于紅細胞而抑制或殺死寄生蟲所致，又可能是作用于吞噬細胞而消除pRBC。
研究人員進一步研究HFn和Fenozyme對巨噬細胞的影響。肝臟中的巨噬細胞主要負責清除應激性紅細胞和回收鐵。通過實驗發現，經Fenozyme和HFn處理的ECM小鼠的肝臟中巨噬細胞數量顯著增加，這表明肝臟中的巨噬細胞在減少寄生蟲病中起了主要作用。而且通過評估巨噬細胞對pRBC的吞噬能力發現，Fenozyme可能通過增強巨噬細胞的增殖和吞噬作用來降低ECM小鼠的寄生蟲血癥。
圖4. Fenozyme通過增強巨噬細胞的增殖和吞噬作用來降低ECM小鼠的寄生蟲血癥
要點4. Fenozyme誘導巨噬細胞向M1極化
巨噬細胞可分化為具有促炎和殺微生物活性的M1亞型，或具有抗炎和促腫瘤作用的M2亞型。為了了解Fenozyme是否會影響巨噬細胞分化，研究人員對Raw264.7細胞和PKC細胞在用Fenozyme和HFn處理后，都增加了M1相關信號的激活。因此，Fenozyme可以通過HFRs誘導初級和轉化的巨噬細胞向M1極化。
圖5. Fenozyme誘導巨噬細胞向M1極化
要點5. Fenozyme減輕腦炎和認知障礙
在以青蒿素為基礎治療后的幸存的腦瘧疾患者通常表現出永久性認知障礙。而這些損傷是由血腦屏障破壞、腦部炎癥和神經元損傷引起的。因此，研究人員通過檢測腦中白細胞浸潤的程度，來檢查Fenozyme是否對青蒿素（ARM）處理的ECM小鼠的BBB功能受損發揮了保護作用。實驗發現蒿甲醚聯合Fenozyme治療的ECM小鼠的腦部浸潤的CD45+細胞明顯減少。
而且還評了小鼠的新的客觀識別以及主動和被動回避能力。加入Fenozyme治療組可保護小鼠免受ECM誘導的記憶力損害且具有主動回避能力。綜上所述，這些結果表明，Fenozyme對BBB的保護不僅減少了因腦瘧疾引起的小鼠死亡，而且減輕了感染小鼠認知功能的損害。
圖6. Fenozyme減輕腦炎和蒿甲醚治療ECM小鼠的認知障礙。
小結：
綜上所述，Fenozyme通過與BBB內皮細胞相互作用并清除活性氧而顯著降低了ECM小鼠的死亡率，且可有效緩解在蒿甲醚治療后幸存的ECM小鼠的神經系統后遺癥，表明將其與蒿甲醚聯用可能是治療腦部瘧疾的新策略。
參考文獻：
Zhao, S.; Duan, H.; Yang, Y.; Yan, X.; Fan, K., Fenozyme Protects the Integrity of the Blood–Brain Barrier against Experimental Cerebral Malaria. Nano Letters 2019.
https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.9b03774
