1. 通過加電壓將納米粒子約束在納米孔形成的hotspot里，實現穩定可重復的SERS測試。2. 證明了單分子SERS對四個DNA堿基的檢測和單分子堿基的識別。表面增強拉曼光譜（Surface-Enhanced RamanSpectroscopy, SERS）用激光照射貴金屬納米結構時產生的局域等離子激元（稱為hot spot）來激發并增強吸附在納米結構表面的分子的拉曼信號，當納米結構形成<10 nm的納米間隙時（圖1），間隙里面的hot spot的強度可以使SERS靈敏度達到單分子水平，在生物醫學、環境探測方面有巨大的應用潛力。
圖1. 在SiN納米孔上的金bowtie納米結構用作單分子SERS襯底，bowtie結構中的兩個金納米三角尖尖之間的間隙可以激發出能達到單分子SERS的hot spot在分析領域眾多實際應用中，單分子測序(single-moleculesequencing，又稱為第三代測序技術)是單分子SERS預期能大有作為的一個領域。基因測序大家都不陌生，孕婦懷孕過程中就可以在醫院里定期做DNA測序以監測胎兒可能存在某些疾病的風險，這種測序通常需要收集人體液中大量的DNA并放在醫院的大型測序儀器中操作完成。而單分子測序則是通過加電壓將電解液中的單根DNA穿過單個生物納米孔（孔徑幾個納米的圓筒狀蛋白質，見圖2），由不同DNA堿基堵塞納米孔產生四個不同的電流水平來逐一讀出DNA的每個堿基，進而將整根DNA鏈的堿基序列全部讀出。這種單分子測序儀已經做到了手機大小的有USB接口的便攜式測序儀(Oxford Nanopore Technologies)，市場潛力巨大，已經被在非洲的無國界醫生用于分析伊波拉病毒。這種單分子測序技術立刻被延伸到醫療需要更加巨大的單分子蛋白質測序，預期通過與醫院的數據庫連接，手持式單分子蛋白質測序儀在未來能夠成為像血壓計一樣的個人化醫療儀器，病人在家中就能自我測序體檢，將重大疾病（如癌癥）確診在早期可治療階段，這將是生物醫療領域的又一個革命性突破！圖2. （上）納米孔單分子測序儀原理圖，（下）圓筒狀蛋白質生物納米孔示意圖以及生物納米孔測到的對應不同堿基的電流水平
但是，蛋白質由20個不同的氨基酸組成，要分辨出20個不同的電流水平幾乎不可能。目前各大研究機構和公司正在研究使用熒光標記這20個氨基酸并通過不同波長的單分子熒光來辨別它們，但是仍然難于登天，一來將不同染料分子連接上蛋白質鏈的每個氨基酸已經是接近不可能的任務，二來熒光的發光峰太寬，以至于鄰近的不同染料分子發出來的不同波長的熒光會混合起來像白光一樣難以分辨其中的組分，即所謂的cross-talk現象（圖3）。就像圖1所示，單分子SERS正好能夠解決熒光的這兩個問題：SERS無需標記且拉曼峰非常窄所以避免了cross-talk。雖然目標是測試蛋白質中的單個氨基酸，但是作為起步，仍然以DNA作為待測物，于是問題變成：怎么在溶液的環境下測到單個DNA堿基的SERS？圖3. 熒光cross-talk現象
目前能達到單分子靈敏度的SERS體系通常需要有10 nm以下的納米間隙，大概分為兩類：一是基于膠體的金屬納米粒子團聚；二是用超凈間儀器制備在襯底上的金屬納米結構，例如圖1所示的用電子束刻蝕制備的金納米bowtie結構。兩種體系的單分子SERS一般都是在“干燥”情況下測試染料分子實現的，例如染料分子滴在金納米bowtie結構上自然干燥再進行拉曼測試；而納米膠體則先在溶液狀態下吸附染料分子再滴在硅片上干燥后得到粒子團聚進行拉曼測試。然而，干燥狀態下測試染料分子跟實際應用相去甚遠，一來實際樣品測試多在溶液狀態進行；二來，染料分子是比較容易測得到的，因為染料分子由于帶有苯環所以拉曼散射截面通常比較大，例如是DNA堿基的10 – 100倍。流動性溶液中測試單分子還有兩個問題，一是在納米間隙中hot spot越強的地方間隙越窄，而分子偏偏喜歡流過間隙寬的地方。二是由于DNA帶負電，在加電壓的情況下DNA的流動速度快到不容易測到，而不加電壓時它又不一定流過hot spot間隙。正因為此，圖1只是一個發表于2015年的理論計算模型，到目前仍未見有單分子DNA流過金bowtie結構被測到單分子SERS的實驗文章出現，雖然金bowtie結構早已經制造出來了。基于此，意大利理工學院Francesco De Angelis團隊改用另外一種策略來實現流體中單分子DNA的測試（圖4a）：先讓DNA吸附在納米粒子（圖4d）上，再通過加電壓施加電等離子體力(electro-plasmonic force, 圖4b)把電解液中的納米粒子推進并約束在金納米孔（圖4c）里，使得納米粒子與納米孔壁之間電荷耦合形成電場增強強度達2×104的5 nm左右的納米間隙hot spot(圖4e, f)并激發原來就已經吸附在納米粒子表面的DNA，實現單分子SERS。圖4. 可控電等離子體約束的微流單分子SERS體系
這個體系的特點是納米粒子被約束在納米孔形成的hot spot是可以通過加電壓控制的，從而可以實現穩定可重復的SERS測試。圖5顯示只要加1伏電壓就可以把粒子約束在納米孔里并得到穩定可重復的SERS譜，一旦去掉電壓，納米粒子就會被釋放。當納米粒子表面吸附了多層adenine分子時，作者通過加電壓把納米粒子約束在納米孔里達6分鐘，用每個譜0.1秒的積分時間采集到了相對標準差(RSD)約13%的3600個穩定的SERS譜。圖5. 電壓可控的多分子adenine穩定SERS譜
確保信號可重復性沒問題了，下一步，作者用雙組分SERS(BiASER)方法來驗證這個SERS體系能否測得到單分子堿基。BiASERS顧名思義，總是需要兩個不同類型的分子，可以是cytosin (C)和同位素cytosin (Ciso) 如圖6a-c，adenine和guanine(圖6d-f)，或者thymine和cytosine (圖6g-i)。通過濃度控制，作者將數量相等的兩個不同的分子物理吸附在納米粒子表面上形成submonolayer，然后將納米粒子放進SERS體系測試。如圖6b,e,h所示，如果形成的hotspot夠小，一次只覆蓋并激發其中一種分子，那么在特定波段內就能得到該種分子的單個SERS峰。如果形成的hot spot大到足以覆蓋兩個分子，那么這個hot spot同樣會同時覆蓋兩種分子，得到兩個SERS峰的拉曼譜。由于BiASERS是一個基于統計的方法，在采集到至少1000個拉曼譜時(圖6a,d,g)，單峰的SERS譜比雙峰的SERS譜數量多，就證明了測到單個分子的幾率大，實現了單分子SERS，否則就不是單分子SERS。如圖6c,f,i所示，作者的體系實現了4個堿基的單分子SERS測試。此外，作者還觀察到單分子堿基的動態，例如分子在電場作用下的翻滾(圖6d)。圖6. 基于雙組分SERS的單堿基SERS測試
測到了獨立吸附的單個堿基證明了hot spot的強度夠強了，達到單分子靈敏度了。但是要能識別到DNA鏈中的單個堿基，還需要hot spot的直徑夠小，這是個空間分辨率的問題。于是，作者將單鏈DNA物理吸附在納米粒子上形成submonolayer做SERS測試，通過測試3種不同的單鏈DNA：5’-CCC CCC CCC A-3’ (圖7), 5’-C AAA AAAAAA-3’ (圖8)和5’-AAA AAA AAACTG-3’（圖9），作者都測得了對應的單分子堿基SERS峰，證實了這個體系的實用性，且hot spot直徑根據最大面積的adenine（1.54 nm2）來估計大概在1.4 nm左右。由于之前圖4已經確定hot spot的穩定性，那么圖7-9的單堿基峰閃爍和偏移預示著分子在移動，為下一步應用電等離子體力進行單分子操控提供了可能。圖7. 單條5’-CCC CCC CCC A-3’ 吸附在納米粒子上的單堿基（A）SERS測試
圖8. 單條5’-C AAA AAA AAA-3’吸附在納米粒子上的單堿基(C)SERS測試
圖9. 單條5’-AAA AAA AAA CTG-3’吸附在納米粒子上的單堿基SERS測試單分子測序這個領域是一個生物學家和生理學家的主場，他們所研究的第三代單分子測序技術和市場產業化很接近，使得研究進展的發表都是非常激動人心的。單分子SERS用在這個領域里非常有意義，因為研究成果不僅僅是用來開開會、發發文章，而是可能可以確實地用來造福社會。單分子測序研究者普遍使用的工具是膜片夾電流放大器和熒光顯微鏡，SERS對他們來說還是個新鮮事物。雖然2015年就已經有理論文章（圖1）預言了單分子SERS可以解決他們的問題而走向蛋白質測序，但是一直到2018年才出現第一篇測到了adenine的單分子SERS文章，而這一篇Nat. Comm.是第二篇。目前介紹的數據顯示了單堿基的分辨率，但是這只是利用里數據的一部分，數據里峰的位移和閃爍埋藏著流體中分子的更多動力學信息（如分子構型、熱效應、電磁場梯度效應等）尚未發掘，這預示著SERS可望在單分子蛋白質測序以及蛋白質組學（Proteomics）上大展拳腳。此外單分子測序還有很多重要問題尚未解決，例如蛋白質展開、減慢蛋白質流速等等。目前我組正在研究氨基酸和多肽的單分子SERS測試，希望有更多SERS同行、單分子/單粒子操控、DFT模擬、分子動力學模擬和生物信息學專家參與和合作，有興趣的同行歡迎加入“納米人SERS”QQ群（群號：529847278）來一起探討。Huang, J., Mousavi, M.Z., Zhao,Y. et al. SERSdiscrimination of single DNA bases in single oligonucleotides byelectro-plasmonic trapping. NatCommun 10, 5321(2019)DOI: 10.1038/s41467-019-13242-xhttps://www.nature.com/articles/s41467-019-13242-x
