第一作者：周麗旗、宋敬東、Judy S. Kim
通訊作者：王鵬、Angus I. Kirkland
通訊單位：南京大學、英國牛津大學
研究亮點：
1. 基于衍射數據，首次實現低電子劑量生物病毒冷凍電子衍射疊層計算機重構成像（Cryo-Ptychography）。
2. 該成像技術可獲得生物結構的低輻照損傷、高襯度、寬頻域及微米級大區域的相位信息。
研究背景
冷凍電鏡（Cryo-EM）是解析生物樣品結構的重要手段，通過單顆粒重構（Single particle analysis）技術可以實現小至血紅蛋白尺寸大小的蛋白顆粒大至幾百萬道爾頓量級的蛋白質顆粒的三維成像。近年來冷凍制樣技術、冷凍電鏡設備、高速相機以及三維重構算法的快速發展將蛋白質結構解析分辨率不斷提升至原子級，為高分辨率結構生物學研究提供了重要的支撐。由于生物樣品在高能電子束輻照下極易損傷，因而只能在低電子劑量條件下進行成像。而傳統TEM成像在低電子劑量條件下獲得的圖像面臨襯度弱、信噪比低、低頻缺失等亟待解決的問題。傳統的增強圖像襯度方法有增加離焦量或添加相位板等方法，但增加離焦量又會影響成像的分辨率，而相位板自身則有穩定性等問題。
電子衍射疊層成像（Ptychography）是一種基于4D STEM 衍射數據和計算機重構的成像技術，以其超高分辨、高相位襯度、適用于輕質元素、高電子劑量效率以及三維成像易于實現等優勢，在材料領域受到了廣泛關注并得到了快速發展。
成果簡介
南京大學王鵬課題組聯合中國疾控中心宋敬東以及英國牛津大學Angus Kirkland首次實現了在低電子劑量條件下，對生物病毒的高襯度冷凍電子衍射疊層計算機重構成像技術（Cryo-Ptychography）。
圖1. 實驗成像光路及流程示意圖。
要點1：實驗光路及流程
圖1所示為該研究工作所用實驗光路及流程示意圖，掃描透射（STEM）模式下采用不同入射半角的入射光在一定離焦量條件下掃描樣品，同時使用高速直接電子探測器采集大量衍射數據，再對所采集的4D衍射數據進行計算機重構，最后獲得樣品的高襯度相位圖像。
要點2：不同電子劑量條件下病毒顆粒的冷凍疊層成像相位圖像
如圖2所示分別為不同電子劑量條件下雙層輪狀病毒顆粒（DLPs）及艾滋病毒顆粒（HIV-1）病毒顆粒的冷凍疊層成像相位圖像。對于DLPs，在電子劑量條件為22.8 e/?2（圖a）時，DLPs 顆粒襯度高，顆粒上VP6 蛋白襯度清晰明銳，多個蛋白質顆粒圍成的通道清晰可見；隨著電子劑量的降低，顆粒襯度有所減弱，但即使在超低電子劑量5.7 e/?2的條件下，病毒顆粒襯度依然可見，顆粒上VP6 蛋白依然具有明顯襯度（圖c）。對于HIV-1，電子劑量條件為22.8 e/?2（圖d）時，病毒顆粒細節襯度高，病毒顆粒中包膜（Lipid envelope）及Gag蛋白顆粒襯度明銳；即使在超低電子劑量5.7 e/?2（圖f）的條件下，病毒顆粒襯度依然清晰可見。
圖2. 不同低電子劑量條件下DLPs及HIV-1病毒顆粒的原位冷凍疊層成像相位像 （a-c）DLPs; (d-f) HIV-1；d內小插圖為弧形區域的平均結果；圖中標尺為100 nm。
要點3：低電子劑量下生物樣品微米級大區域疊層衍射成像
圖3所示為腺病毒顆粒感染的細胞在低電子劑量條件27 e/?2的疊層成像相位圖像，成像區域大小為1.14 × 1.14 μm。細胞內亞結構襯度清晰可見，如腺病毒顆粒（b）、空泡（c）、運輸小泡（d）、游離ribosome蛋白顆粒（e）等，且這些亞結構的內部結構襯度清晰，如b中的腺病毒顆粒，殼層六邊形結構明銳，結構核部遺傳物質清晰可見。該結果表明疊層衍射成像（Cryo-Ptychography）可實現生物樣品在低電子劑量條件下的微米級大區域成像。
圖3. 腺病毒顆粒感染的細胞內部微米級區域疊層成像相位圖像；圖中標尺為300 nm。
小結
本研究工作首次實現了低電子劑量條件下冷凍生物樣品的電子衍射疊層成像（Cryo-Ptychography），從理論上揭示該方法具備更寬的信息傳輸頻域帶寬，并從實驗上展示了低電子劑量條件下雙層輪狀病毒顆粒（DLPs）以及類艾滋病毒顆粒（HIV-1）的高襯度相位成像以及常溫條件下腺病毒感染細胞切片微米級大區域的成像。
展望
本研究為結構生物學研究中蛋白結構的高分辨、高襯度和高信噪比成像表征提供一個嶄新的技術思路和手段。
參考文獻
Liqi Zhou et al，Peng Wang；Low-Dose Phase Retrieval of Biological Specimens using Cryo-Electron Ptychography. Nature Communications, 2020（11）2773.
DOI：10.1038/s41467-020-16391-6
https://www.nature.com/articles/s41467-020-16391-6
作者簡介
該研究成果以“Low-Dose Phase Retrieval of Biological Specimens using Cryo-Electron Ptychography”為題，于2020年6月2日在Nature Communications上發表（DOI：10.1038/s41467-020-16391-6）。南京大學現代工程與應用科學學院博士研究生周麗旗(2016級)、中國疾病預防控制中心宋敬東研究員以及牛津大學Judy S. Kim博士為文章的共同第一作者，南京大學現代工程與應用科學學院碩士研究生裴旭東（2018級）為第二作者，南京大學王鵬教授和英國牛津大學Angus Kirkland教授為共同通訊作者。
該研究工作得到了牛津大學黃琛博士、英國國家同步輻射中心Diamond的物理材料電鏡中心（ePSIC）和生物電鏡中心（eBIC）兩大中心及其科研人員、英國牛津大學David Stuart教授、美國加州大學爾灣分校潘曉晴教授，英國牛津大學Peter Nellist教授和Peijun Zhang教授等的大力支持；得到了國家自然基金面上項目、南京大學優秀博士研究生創新能力提升計劃A等項目的資助；固體微結構物理國家重點實驗室，江蘇省人工智能材料重點實驗室以及人工微結構科學與技術協同創新中心提供了大力的支持。
課題組簡介鏈接：https://wangstem.com/
