2017年，諾貝爾化學獎授予Jacques Dubochet, Joachim Frank和Richard Henderson三位科學家，以表彰他們在冷凍電鏡領域的貢獻。冷凍電鏡使得高分辨率觀測蛋白質等活性生物大分子結構成為可能，為結構生物學迎來了一個嶄新的時代。
2017年以來，冷凍電鏡一直在尋找突破，以擺脫X-射線晶體學，成為結構生物學領域的絕對霸主。但是，它還存在一個關鍵問題懸而未決：分辨率不夠高！
5月22日，兩個實驗室在bioRxiv預印本同時發表文章，報道了一項革命性的突破：第一次看見蛋白質中的單個原子。
這一研究表明，冷凍電鏡打破了一個關鍵的障礙，它將使人們能夠以前所未有的分辨率來探索蛋白質的工作原理，這是其他成像技術（例如X射線晶體學）無法輕易實現的。這一研究鞏固了冷凍電鏡在繪制蛋白質3D形狀圖譜中的主導工具地位，并將幫助研究人員了解蛋白質如何在健康和疾病中起作用，并促使產生更好的和更少副作用的藥物。
兩篇文章分別來自德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所的生物化學家和電子顯微鏡學家Holger Stark團隊，和英國劍橋分子生物學醫學研究委員會實驗室(MRC-LMB)的結構生物學家Sjors Scheres和Radu Aricescu領導的團隊。
Holger Stark說：“這是一個里程碑，突破最后一道分辨率屏障，真的沒有什么可以打破了。”
加拿大多倫多大學結構生物學家John Rubinstein也盛贊：“這是真正的‘原子分辨率’，真正是一個里程碑。”
蛋白質Apoferritin的冷凍電鏡圖。
圖片來源：Paul Emsley/MRC Laboratory of Molecular Biology
突破界限
冷凍電鏡的發展已有數十年歷史，它通過在電子樣品上發射電子并記錄所得圖像來確定其形狀。探測反彈電子的技術和圖像分析軟件的進步催生了一場始于2013年左右的“分辨率革命”。這使得蛋白質結構比以往任何時候都更清晰，幾乎與X射線晶體學獲得的結構一樣好，X射線晶體學是一種更古老的技術，當蛋白質晶體受到X射線轟擊時，它會從蛋白質晶體的衍射圖案中推斷出結構。
隨著硬件和軟件進步，雖然冷凍電鏡結構分辨率得到進一步提高。但是科學家們在很大程度上依賴于X射線晶體學來獲得原子分辨率的結構。這就產生了一個關鍵問題：研究人員可能要花費數月至數年的時間才能使蛋白質結晶，此外，許多醫學上重要的蛋白質也無法形成有用的晶體。相比之下，冷凍電子顯微鏡只需要蛋白質在純化溶液中即可。
原子分辨率圖的精確度足以精確識別蛋白質中單個原子的位置，分辨率約為1.2 ?（1.2′10-10 m）。這些結構對于了解酶的作用方式以及利用這些見解來識別可阻斷其活性的藥物特別有用。
為了推動冷凍電鏡達到原子分辨率，兩個團隊致力于一種名為脫鐵鐵蛋白（apoferritin）的儲鐵蛋白質的研究。由于其巖石般的穩定性，這種蛋白質已經成為冷凍電鏡的專屬實驗樣品：之前的紀錄是分辨率為1.54 ?的蛋白質結構。
然后，研究小組利用技術改進，拍攝了更清晰的脫鐵鐵蛋白照片。Stark的研究小組得到了這種蛋白質1.25 ?的結構，他們通過一種巧妙的裝置，可以確保電子在撞擊樣本前以相似的速度移動，從而提高了最終圖像的分辨率。Scheres、Aricescu和他們的團隊使用了一種不同的技術來發射以相似速度移動的電子，此外，他們還發明了一種新技術，可以減少一些電子在離開蛋白質樣本后產生的噪音，以及一種更靈敏的電子檢測攝像頭。Scheres說： 蛋白質的1.2 ?的結構如此完整，以至于他們可以分辨出蛋白質和周圍水分子中的單個氫原子。
Stark認為，將這些技術融合在一起可以將分辨率提高到1 ?左右，但低于1?，冷凍電鏡幾乎是不可能實現的。
更清晰的觀測
Scheres和Aricescu還驗證了一種名為GABAA受體的蛋白質。這種蛋白質位于神經元的膜上，是全身麻醉劑、焦慮藥物和許多其他藥物的靶標。去年，Aricescu的團隊使用冷凍電鏡將這種蛋白質定位到2.5 ?。使用新方法后，研究人員獲得了1.7 ?的分辨率，甚至在蛋白質的某些關鍵部位也獲得了更高的分辨率。“這就像剝掉了你眼睛上一層模糊的東西。” Aricescu說，“在這個層次的分辨率下，分辨率每提高半個?，就會打開一個新的宇宙。”
這種結構揭示了蛋白質中前所未有的細節，包括一種叫做組胺的化學物質所在的口袋里的水分子。“這是基于結構進行藥物設計的金礦，”Aricescu說，因為它展示了藥物如何取代水分子的機理，從而潛在地減少了藥物的副作用。
Scheres說，GABAA的原子分辨率圖并不像脫鐵鐵蛋白那樣穩定，這將是一個挑戰。我不認為這是不可能的，但這是非常不現實的，因為需要收集大量的數據。但是其他的改進，特別是在如何制備蛋白質樣品方面，可能會為GABAA和其他生物醫學重要蛋白質的原子分辨率結構鋪平道路。蛋白質溶液被凍結在由黃金制成的小網格上，這些網格可以使蛋白質保持更穩定。
“每個人都對MRC-LMB和Max-Planck團隊所展示的令人震驚的分辨率水平感到非常興奮和驚訝，”東京大學冷凍電鏡專家Radostin Danev說。但他也認為，對于更不穩定的蛋白質來說，樣品制備是該領域的主要挑戰。他說：“一段時間內，只有表現良好的樣品才能獲得低于1.5?或2?的分辨率性能。”。
Scheres說，這些突破可能會鞏固冷凍電鏡作為大多數結構研究的首選工具的地位，渴望原子分辨率結構的制藥公司可能更傾向于使用冷凍電鏡。但Stark認為X射線晶體學仍然有一定的吸引力。如果一種蛋白質能夠結晶，那么在很短的時間內將其結構與成千上萬種潛在藥物結合是相對有效的。但是，要生成足夠的數據以用于超高分辨率的冷凍電子顯微鏡結構，仍需要花費數小時甚至數天的時間。
Stark認為：“每種技術仍然有優缺點，有人說，冷凍電鏡基于這些最新突破性進展將完全取代X射線晶體學，我對此表示懷疑。”
參考文獻：
“It opens up a whole new universe”: Revolutionary microscopy technique sees individual atoms for first time. Nature, 2020.
DOI: 10.1038/d41586-020-01658-1
https://www.nature.com/articles/d41586-020-01658-1
