第一作者：魏妥，程強
通訊作者：Prof. Daniel J. Siegwart
通訊單位：美國德克薩斯大學西南醫學中心
CRISPR-Cas9作為一種強大的基因編輯工具，已被廣泛應用于生物醫學領域的各個方面。目前，遞送CRISPR-Cas9 核酸酶系統主要有三種方式：質粒遞送、Cas9mRNA/sgRNA共遞送和Cas9/sgRNA核糖核蛋白 （RNPs）遞送。由于低脫靶效應和低免疫原性的優勢, RNPs遞送越來越受到科學家們的青睞。然而RNPs具有分子量大、負電性強以及易失活等缺點，體內遞送極具挑戰。
奇物論曾報道過美國德克薩斯大學西南醫學中心Daniel J. Siegwart教授課題組發表于Nature Nanotechnology的“器官選擇性靶向（SORT）納米顆粒”，在mRNA遞送和CRISPR/Cas基因編輯的應用方面發揮巨大潛力。（深度解讀，附專訪）
近日，該課題組又乘勝追擊，通過對傳統脂質納米顆粒（LNPs）的簡單改造，成功解決了RNPs的體內遞送難題，并高效介導了體內器官選擇性的基因編輯（圖1）。相關研究成果發表于Nature Communications上，題為“Systemic nanoparticle delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteinsfor effective tissue specific genome editing”。
圖1 |脂質納米顆粒5A2-DOT-X LNPs體內靶器官遞送Cas9/sgRNA RNPs的策略。
研究亮點：
1.本文開發的脂質納米顆粒5A2-DOT LNPs可實現Cas9/sgRNA RNPs的體內靶器官遞送和高效基因編輯；
2.5A2-DOT LNPs可同時敲除多個基因位點，成功、快速地構建了器官特異性小鼠腫瘤模型；
3. 5A2-DOTLNPs可成功實現對小鼠疾病模型的基因編輯治療，對遺傳類疾病的治療具有廣泛的應用前景。
要點1: 5A2-DOT LNPs的開發過程
通常，LNPs包裹RNA的過程是在酸性緩沖液中完成。在酸性條件下，LNPs中的可電離陽離子脂質（ionizable cationic lipid）會帶上正電荷，從而完成對負電荷RNA的包裹。與RNA不同，Cas9/sgRNA RNPs在酸性條件下極易失去活性，而在中性條件下更穩定。因此，研究人員必須嘗試在中性緩沖液中包裹Cas9/sgRNA RNPs。可惜的是，可電離陽離子脂質在中性環境中并不會發生質子化，因此無法吸引帶負電荷的Cas9/sgRNA RNPs。基于前期積累的經驗，Daniel J. Siegwart教授課題組在LNPs原有的四種核心脂質的基礎上引入了第五種陽離子脂質（DOTAP），這樣不僅能增強其在中性條件下對Cas9/sgRNA RNPs的包載，而且保留了傳統LNPs的高效遞送能力。通過該策略，他們成功地將Cas9/sgRNA RNPs遞送到細胞內，基因編輯效率高達80%以上。
要點2：5A2-DOT LNPs可實現對 RNPs的體內靶器官遞送和高效基因編輯
研究人員發現，將包裹Cas9/sgTOMRNPs的5A2-DOT-10 LNPs局部注射到tdTOM模型小鼠的肌肉和腦部，可成功實現對小鼠肌肉細胞和腦細胞的基因編輯，激活tdTomato基因并使之表達紅色熒光。（圖2a-e）
基于該課題組前期開發的Selective ORgan Targeting (SORT)技術，研究人員在原有四種脂質組分比例（5A2-SC8 :DOPE: Chol : PEG = 15:15:30:3）的基礎上，通過調節DOTAP的摩爾比（5%-60%）制成了一系列包裹Cas9/sgTOM RNPs的5A2-DOT-X LNPs，并將其靜脈注射到tdTOM模型小鼠和C57BL/6小鼠中。研究發現，隨著DOTAP摩爾百分比的增加，基因編輯逐漸從小鼠肝臟轉移到肺部，且肺部基因編輯效果更高。此外，研究人員還發現在低劑量下（0.33 mg kg?1 sgRNA），5A2-DOT-50LNPs可高效遞送多達6種sgRNA到小鼠肺部，并成功對針對的6個基因位點進行基因敲除。（圖2f-j）
圖2 | Cas9/sgRNA RNPs的體內靶器官遞送和高效基因編輯。
要點3：5A2-DOT LNPs可快速構建器官特異性小鼠腫瘤模型
鑒于5A2-DOT LNPs可同時敲除多個基因位點，這對快速構建復雜的小鼠腫瘤模型具有極大的優勢。因此，研究人員通過肝靶向納米載體（5A2-DOT-5 LNPs）和肺靶向納米載體（5A2-DOT-50 LNPs）分別遞送多種不同的sgRNAs, 成功構建了小鼠肝癌模型和肺癌模型。該方法簡單、快捷，為新型小鼠腫瘤模型的建立提供了新的思路。
圖3 | 5A2-DOT LNPs可簡化小鼠肝癌模型和肺癌模型的構建。
要點4：5A2-DOTLNPs可成功實現對小鼠遺傳類疾病模型的基因編輯治療
研究人員進一步探索了5A2-DOT LNPs對小鼠遺傳類疾病模型的治療潛力。通過與德克薩斯大學西南醫學中心Eric N. Olson教授課題組合作，將包裹Cas9/sgDMD RNPs 的5A2-DOT-10 LNPs局部肌肉注射到杜氏肌營養不良癥模型小鼠（ΔEx44 DMDmice）中，可成功對模型鼠肌肉細胞中的突變基因進行基因編輯和修復，并成功恢復了dystrophin蛋白在肌肉中的表達。（圖4a-c）
接著，研究人員探索了肝靶向基因編輯的治療潛力，以PCSK9為研究靶點。靜脈注射5A2-DOT-5 Cas9/sgPCSK9 RNPs到小鼠體內后，成功在小鼠肝臟中檢測到PCSK9位點的基因編輯，且使小鼠血清中PCSK9蛋白的表達水平顯著降低。（圖4d-f）
圖4 | 5A2-DOT LNPs可成功實現對小鼠遺傳類疾病模型的基因編輯治療。
小結：
本文提供了一種器官選擇性遞送RNPs的有效策略。在傳統脂質納米顆粒組分的基礎上引入一個永久性陽離子脂質，改進了包載RNPs的方法，使之能在中性緩沖液中進行，從而達到保護Cas9蛋白生物活性的目的。通過調節永久性陽離子脂質的加入比例，該文成功實現了RNPs的系統遞送和器官選擇性基因編輯。開發的RNPs遞送體系不僅可以簡化小鼠原位腫瘤模型的構建，還表現出了在遺傳類疾病中基因治療的應用價值。
參考文獻及原文鏈接：
Wei,T., Cheng, Q., Min, Y. et al. Systemic nanoparticle delivery of CRISPR-Cas9ribonucleoproteins for effective tissue specific genome editing. Nat Commun 11,3232 (2020).
https://doi.org/10.1038/s41467-020-17029-3
通訊作者：
DanielJ. Siegwart是德克薩斯大學西南醫學中心的副教授。他的研究計劃專注于開發先進的基于聚合物和脂質的系統，該系統可精確控制大分子的結構、順序和響應性，以用于藥物輸送、成像、遺傳疾病和癌癥。他是ReCode Therapeutics公司的共同創始人，致力于修飾tRNA負載的納米顆粒，用于糾正引起囊性纖維化和其他疾病的無義突變。
