第一作者：李蘇昕 博士
通訊作者：高金明 教授
通訊單位：美國德克薩斯大學西南醫學中心
具有pH響應功能的材料可以通過感知機體微環境作出響應，作為診斷試劑或治療藥物的遞送載體而備受關注，然而材料自身的生物學性質往往被忽略。最近德克薩斯大學西南醫學中心高金明教授課題組另辟蹊徑，報道了一種具有pH超敏性能的的高分子聚合物免疫激動劑，能夠響應微酸性環境進入免疫細胞的細胞質中，通過與細胞內的STING蛋白多價結合發生相轉變過程，促使STING形成膠連體(biomolecular condensate)，從而更高效地招募并激活下游蛋白，并表現出異于小分子激動劑的臨床適用范圍及長效免疫活化作用。相關成果發表在Nature Biomedical Engineering上，題為“Prolonged activation of innate immune pathways by a polyvalent STING agonist”。
背景介紹：
STING得名于干擾素基因刺激蛋白(Stimulator of interferon genes)，在近年來已成為免疫治療的明星靶點，廣泛應用于治療感染性疾病與惡性腫瘤的研究中。STING是生物體天然免疫系統的核心組成成分，表達于各類細胞中，通過上游cGAS通路識別細胞質中的雙鏈DNA作為危險信號被激活，進而促進I型干擾素(IFN-I)的分泌以及多種促炎癥因子與趨化因子的產生，并通過一系列級聯反應，誘導適應性免疫系統的激活，最終促進效應T細胞的增殖與活化。制藥公司對以STING為靶點的藥物開發表現出了罕見的熱情，近五年來Aduro/諾華， 默沙東， 默克，葛蘭素史克等公司先后研制出以STING為靶點的小分子激動劑進入臨床一期用于單一或聯合治療實體瘤與淋巴瘤，然而早期的臨床數據表明令人失望，患者的響應率并不高。小分子藥物在體內的代謝快、對腫瘤的選擇性差成為制約其在臨床安全有效應用的主要屏障。如何設計出能夠高效靶向細胞質中分布的STING蛋白的新型激動劑成為研究的最新熱點。
高金明團隊早期通過將腫瘤特異性抗原片段包載在pH超敏性聚合物膠束(Ultra-pH-sensitive NPs, UPS)中構建了一種新型抗腫瘤納米疫苗，該制劑在多種荷瘤小鼠模型中表現出良好的抑制腫瘤生長的能力。UPS可以通過內吞體逃逸機制幫助腫瘤抗原在抗原呈遞細胞的細胞質中釋放并呈遞給MHC-I類分子，從而誘導CD8+ T細胞的活化與對腫瘤細胞的殺傷。有趣的是，研究人員發現當使用一種自組合成的名為PC7A的UPS聚合物膠束遞送抗原的同時，其也能在一定程度上發揮免疫佐劑的功效，然而當時并不清楚具體免疫激活的機理。在最新的研究中，作者采用分子生物學手段對PC7A激活STING信號通路進行了深入的機制分析，并以此為基礎設計構建了新一代STING高分子激動劑，在多種動物模型及臨床病人組織樣本上驗證了所得藥劑的免疫刺激功能和腫瘤治療的潛力。
研究亮點：
1.首次報道了人工合成的高分子STING激動劑，與小分子激動劑相比具有不同的結合模式與生物特征，為新一代臨床可用的STING激動劑的設計提供了新的思路。
2.高分子激動劑與STING蛋白通過多價結合相互作用并發生相轉變形成膠連體，更加高效地激活下游免疫信號通路。
3.將高分子STING激動劑與小分子激動劑(cGAMP)聯合制備成新的納米制劑(cGAMP-PC7A NPs)，以治療不同臨床亞型的個體，并且表現出迅速而持久的免疫應答反應。
要點1：高分子納米粒的pH響應型，高效“靶向”免疫細胞細胞質中的STING蛋白
STING蛋白表達于細胞質中的內質網上，一般的小分子藥物很難通過細胞膜屏障進入細胞內部與STING發生相互作用，同時其容易被組織中大量存在的酶水解而失活，因此臨床中療效欠佳。高分子PC7A在進入體內后以納米膠束形式穩定存在，一旦被細胞捕獲內吞，膠束粒子進入早期內吞體并響應酸性環境解離成為單鏈形式，并釋放至細胞質中，與STING蛋白發生相互作用。
等溫量熱滴定法結果表明，具有側鏈為環形叔胺的高分子聚合物PC7A比側鏈為線形叔胺的聚合物PEPA表現出更強的STING結合能力(72nM vs 671nM)，細胞實驗也證實PC7A具有更強的激活STING信號通路產生效應分子I型干擾素的能力（圖1）。
圖1. PC7A高分子聚合物對STING蛋白具有較強的結合與激活能力
要點2：PC7A以異于小分子激動劑的結合模式與STING作用，表現出針對多種臨床亞型的響應行為及持久的免疫活化能力
通過計算機模擬與定點氨基酸突變技術，作者揭示了PC7A與STING的結合發生在PC7A的支鏈含氮七元環與STING二聚體側面的E296-D297序列區域（圖2a）。由于PC7A聚合物含有數十個重復結構單元，同時STING二聚體可以提供兩個結合位點，二者發生多價結合發生形成復合膠連結構（圖2b）。STING蛋白在此膠連體中局部濃度富集并以寡聚體形式存在，有利于對下游蛋白TBK1與IRF3的招募與磷酸化。在顯微鏡下可以觀察到由STING與PC7A組成的微米級別的膠連體的形成以及其與p-TBK1的共定位（圖2c）。這種STING蛋白由游離相變為膠連體的過程稱之為“相轉變”。相轉變的發生成濃度依賴性，當增加STING蛋白或PC7A的濃度時，將會形成數量更多的膠連體（圖2d）。同時研究表明，相轉變的程度，生物效應的產生，與PC7A重復單元的數目（即價位）直接相關。若使用低重復單元（如20）的聚合物，則膠連程度很低，STING激活能力較差；若使用很高重復單元（如110）的聚合物，雖然膠連大量發生，但生物效應卻不甚強，可能與STING功能的飽和以及結合模式的不可逆有關；當選擇適中的重復單元（如70）的聚合物時，生物效應達到最高值（圖2e）。
圖2. PC7A通過多價結合的相轉變過程激活STING
有趣的是，由于與STING的作用模式不同以及獨特的pH響應介導的胞內內吞體逃逸行為，聚合物納米粒較小分子激動劑（如cGAMP）表現出緩慢而持久的免疫激活能力：起效時間為12h之后，并在48h時仍可檢測到IFN-I的產生（圖3a,b）。同時，STING蛋白有許多亞型表達，如232號氨基酸發生突變的亞型在臨床上可占到近20%，這部分的突變體對小分子激動劑響應能力大幅度降低，而PC7A高分子激動劑仍然表現出較高的免疫激活能力（圖3c-e）。
圖3. PC7A具有緩慢而持久的免疫刺激活性，并對多種臨床亞型表現出響應能力
要點3：結合高分子與小分子激動劑在動物及臨床樣本中取得良好免疫應答活性
圖4. 雙重STING靶向制劑cGAMP-PC7A NPs具有良好的腫瘤免疫治療能力
利用小分子(cGAMP)與高分子聚合物(PC7A)二者與STING的非競爭結合位點與互補的免疫激活時間曲線，作者將兩種激動劑聯用制備了對STING具有雙重靶向作用的聚合物納米顆粒(cGAMP-STING NPs)。所得藥劑在多種荷瘤小鼠模型中均取得了顯著的腫瘤抑制能力（圖4a-d），當與PD-1抗體聯用時在MC38結腸癌模型中更是表現出100%的抗腫瘤效果；在病人的離體腫瘤組織與淋巴樣本中進行測試時亦展示了良好的免疫激活的臨床轉化潛力（圖4e,f）。進一步機制研究發現，納米制劑起效的靶點為宿主自身的STING信號通路而非腫瘤細胞所表達的STING，通過激活宿主的免疫系統最終由CD8 效應T細胞發揮抗腫瘤的能力。
小結：
本研究合成了一種高分子STING激動劑，通過多價結合誘導STING蛋白膠連發生相轉變，進而激活免疫系統發揮抗腫瘤的功效。不同的結合模式導致了高分子激動劑產生異于小分子激動劑的作用位點、空間分布、以及時間-藥效曲線，為下一代STING激動劑的開發提供了新思路。目前研究人員正在將所得結果進行臨床轉化。
本論文第一作者為李蘇昕博士，通訊作者為高金明教授。
參考文獻：
Li, S., Luo, M., Wang, Z. et al. Prolonged activation of innate immune pathways by a polyvalent STING agonist. Nat Biomed Eng (2021).
https://www.nature.com/articles/s41551-020-00675-9
通訊作者：
Prof. Jinming Gao是美國德克薩斯大學西南醫學中心的教授。他帶領的課題組的一項杰出成就是發明了“proton transistor” 技術，該技術可以數字化分析生物學和醫學領域的酸信號。高教授與他的長期合作者，頭頸癌外科醫師Baran Sumer博士共同創立了OncoNano Medicine。熒光納米顆粒傳感器ONM-100已成功完成了對30位癌癥患者的I期臨床試驗，并獲得了FDA的快速批準，從而開始了全癌手術的II期試驗。近年來，研究團隊已進入免疫腫瘤學領域。STING納米顆粒疫苗（ONM-500）是其另一項發明，已從CPRIT獲得1540萬美元，用于HPV誘導的癌癥的T細胞免疫療法。作為美國國家癌癥研究所癌癥月球計劃的一部分，高教授及其團隊最近獲得了U54納米免疫工程中心獎，以開發創新的納米療法來促進癌癥免疫療法。
