第一作者：張震
通訊作者：賀超良、陳學(xué)思
通訊單位：中國科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
研究背景：
順鉑 (CDDP) 是治療各種上皮惡性腫瘤的一線化療藥物之一。然而，伴隨的腎毒性、胃腸道毒性、周圍神經(jīng)病變和耳毒性等副作用嚴(yán)重危害病人健康。近幾十年來，為了降低副作用，實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位更高的藥物濃度以及在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)可控的藥物釋放，人們研究開發(fā)了多種可控給藥系統(tǒng)[1]。其中可注射的共價(jià)交聯(lián)水凝膠系統(tǒng)由于其優(yōu)越的機(jī)械性能和長(zhǎng)期穩(wěn)定性在藥物遞送方面得到了廣泛的研究[2]?？勺⑸渌z一般通過物理相互作用或共價(jià)鍵形成， 其中物理水凝膠可以在特別溫和的條件下形成，但它們通常是機(jī)械強(qiáng)度與長(zhǎng)期穩(wěn)定性較低。共價(jià)鍵水凝膠具有良好的機(jī)械性能與穩(wěn)定性，但是在交聯(lián)反應(yīng)過程中的副反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)具有細(xì)胞毒性，降低了水凝膠的生物相容性。因此，如何制備具有優(yōu)異機(jī)械性能、長(zhǎng)期穩(wěn)定及良好生物相容性的水凝膠是一個(gè)關(guān)鍵難題。
成果簡(jiǎn)介：
近日，中國科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所張震博士、賀超良教授與陳學(xué)思教授報(bào)道了通過四嗪-降冰片烯的逆電子需求Diels-Alder（iEDDA）點(diǎn)擊反應(yīng)制備了可注射聚氨基酸水凝膠用于順鉑的局部釋放。該水凝膠藥物緩釋系統(tǒng)具有可控的機(jī)械性能，長(zhǎng)期穩(wěn)定并且具有良好的生物相容性，通過藥物緩釋結(jié)果亦證明該藥物遞送系統(tǒng)具有抗腫瘤作用并且降低了全身毒性?？傮w而言可注射點(diǎn)擊聚氨基酸水凝膠在局部的持續(xù)腫瘤藥物傳遞方面具有較大的潛力。
要點(diǎn)1：無銅點(diǎn)擊聚氨基酸水凝膠的制備和表征
作者通過降冰片烯改性聚（L-谷氨酸）（PLG-Norb）和 四嗪官能化四臂聚（乙二醇）（4aPEG-T）之間發(fā)生逆電子需求Diels-Alder（iEDDA）點(diǎn)擊反應(yīng)制備可注射水凝膠，其中PLG-Norb 用于與 CDDP 形成聚合物-金屬絡(luò)合，藥物釋放過程在PBS中進(jìn)行模擬，合成過程如方案1所示。
方案1：（A，B）降冰片烯改性聚（L-谷氨酸）（PLG-Norb）和四臂聚（乙二醇）（4aPEG-T）的合成路線：a）己胺，N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)，室溫，72 小時(shí)；b) 氫溴酸，二氯乙酸，室溫，2 小時(shí)；c) 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC·HCl)、4-二甲氨基吡啶 (DMAP)、DMF，室溫，72 小時(shí)；d) N2H4·H2O，乙醇，90℃，10小時(shí)；e) 亞硝酸異戊酯，乙酸，室溫，過夜；f) EDC·HCl，N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），DMF，40℃，過夜；g) 二甲亞砜 (DMSO)，50 °C，48 小時(shí)。(C) 用于局部治療腫瘤的可注射點(diǎn)擊聚氨基酸水凝膠的示意圖。
圖1：(A) 聚合物濃度為 3%、4%、5% (w/v)，[N]/[T] 為 1:1，(B) 聚合物濃度為 4% (w/v)，[N]/[T] 為 2:1、1:1、1:2時(shí)，水凝膠的儲(chǔ)能模量 (G') 和損耗模量 (G") 隨時(shí)間的變化。(C) 點(diǎn)擊聚氨基酸水凝膠的 SEM 圖像。(D) 含或不含 5 U/mL 彈性蛋白酶的 PBS 中水凝膠的體外降解曲線。
為了研究交聯(lián)過程中的流變行為，監(jiān)測(cè)了水凝膠的 G' 和 G'' 隨時(shí)間的變化。水凝膠的 G' 隨聚合物濃度和降冰片烯基團(tuán)與四嗪基團(tuán)的摩爾比（表示為 [N]/[T]）而變化。SEM 被用來檢測(cè)凍干水凝膠的內(nèi)部形態(tài)。如圖 1C 所示，水凝膠具有高度多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可能有利于藥物運(yùn)輸。聚合物材料的降解是藥物遞送系統(tǒng)的主要問題。希望水凝膠在藥物耗盡后降解以避免額外的手術(shù)去除載體。通過監(jiān)測(cè)剩余質(zhì)量來研究水凝膠在含有彈性蛋白酶的 PBS 中的體外降解行為。如圖 1D 所示，水凝膠的質(zhì)量在 6 天內(nèi)不斷減少，這應(yīng)該歸因于 PLG 主鏈的逐漸分解和隨之而來的聚合物網(wǎng)絡(luò)的降解。
要點(diǎn)2：載 CDDP 的水凝膠體外釋放分析
圖2：(A) 在 5 mM PB (pH 7.4) 中聚合物濃度為 0.01 mg/mL 時(shí)的 CD 光譜。(B) 順鉑 (CDDP) 負(fù)載水凝膠的凝膠動(dòng)力學(xué)，CDDP 濃度為 2 和 3 毫克/毫升。(C) 在 PBS 或 PB（不含 NaCl）中，CDDP 從水凝膠中的體外釋放曲線。
負(fù)載 CDDP 的水凝膠的流變測(cè)試表明凝膠化速率降低。如圖 2B 所示，當(dāng) CDDP 與 PLG-Norb 骨架結(jié)合時(shí)，由于空間位阻增加，G' 需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到相同的值。CDDP 從水凝膠的體外釋放曲線在 37°C 的 PBS 中進(jìn)行評(píng)估。在 12 天的測(cè)試期間，由于從 PLG-Norb 的羧基到氯離子的配體交換，34% 的 CDDP從水凝膠中持續(xù)釋放出來（圖2C）。相比之下，在不含 NaCl 的 PB 中，只有 6.7% 的 CDDP 從水凝膠中釋放出來。
要點(diǎn)3：負(fù)載 CDDP 的水凝膠體外細(xì)胞學(xué)分析
圖 3. (A) 載有 CDDP 的水凝膠對(duì) MCF-7 細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。(B) 由載有 CDDP 的水凝膠誘導(dǎo)的 MCF-7 細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞儀分析。
使用 MCF-7 細(xì)胞評(píng)估了負(fù)載 CDDP 的水凝膠的體外腫瘤細(xì)胞抑制效率。如圖 3A 所示，水凝膠本身沒有表現(xiàn)出可檢測(cè)到的細(xì)胞毒性，細(xì)胞活力保持在 95% 以上。相比之下，載有 CDDP 的水凝膠以劑量依賴性方式抑制 MCF-7 細(xì)胞的增殖。孵育 24 小時(shí)后，細(xì)胞活力從 90.7% 降低到 41.0%。由于 Pt 復(fù)合物的持續(xù)釋放，增加孵育時(shí)間進(jìn)一步增強(qiáng)了負(fù)載 CDDP 的水凝膠的抗腫瘤作用。如圖 3B 所示，與 PBS 組 (38.35%) 相比，負(fù)載 CDDP 的水凝膠誘導(dǎo) MCF-7 細(xì)胞的 S 期停滯 (50.10%)，而空白水凝膠孵育的 MCF-7 細(xì)胞在不同階段的百分比與 PBS 組的相當(dāng)。這進(jìn)一步證明了基于 iEDDA 的聚氨基酸水凝膠的細(xì)胞相容性。
要點(diǎn)4：水凝膠的體內(nèi)生物相容性分析
圖 4.水凝膠的體內(nèi)生物相容性。(A) 在不同時(shí)間間隔后皮下注射到大鼠體內(nèi)的水凝膠代表性圖像。在相應(yīng)的時(shí)間間隔后水凝膠和周圍組織的 (B) H&E 染色和 (C) 馬森三色染色。星號(hào)表示水凝膠的位置。
為了研究無銅點(diǎn)擊聚氨基酸水凝膠的體內(nèi)生物相容性，將 PLG-Norb 和 4aPEG-T 的 PBS 溶液在混合后皮下注射到大鼠背部。在不同的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠并通過手術(shù)解剖注射部位以暴露水凝膠與相鄰皮膚。據(jù)觀察，水凝膠可以在注射部位形成而不會(huì)外滲到周圍組織中。由于降冰片烯和四嗪基團(tuán)之間的反應(yīng)形成了穩(wěn)定的共價(jià)鍵，4 周內(nèi)水凝膠保持其結(jié)構(gòu)完整性，并且發(fā)現(xiàn)在水凝膠周圍形成薄的纖維囊（圖 4）。此外，通過 H&E 和 Masson 三色染色處理水凝膠周圍的宿主組織評(píng)估炎癥反應(yīng)。注射后1周，觀察到炎癥細(xì)胞增多，膠原沉積增多，顯示初期為急性炎癥反應(yīng)。之后，炎癥細(xì)胞逐漸減少。實(shí)驗(yàn)過程中未觀察到肉眼可見的水腫、充血和組織壞死。因此，結(jié)果表明水凝膠具有良好的穩(wěn)定性和組織相容性。
要點(diǎn)5：載有 CDDP 的水凝膠的體內(nèi)抗腫瘤功效分析
圖 5. 載有 CDDP 的水凝膠治療攜帶 MCF-7 異種移植瘤的 BALB/c 裸鼠的體內(nèi)抗腫瘤功效。(A) 相對(duì)腫瘤體積。(B) 相對(duì)體重。箭頭表示在第 0、3、7 天以 3.3 mg/kg 的劑量注射 3 次游離 CDDP。數(shù)據(jù)表示平均值 ± SD；值通過單向方差分析，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。(C) 第 14 天小鼠腫瘤組織和主要器官的 H&E 染色。
為了評(píng)估體內(nèi)抗腫瘤功效，小鼠在第 0、3、7 天接受了 3 次游離 CDDP 瘤周注射，每次劑量為 3.3 mg/kg。如圖 5A 所示，在 PBS 組中，腫瘤大小在實(shí)驗(yàn)過程中迅速增加。相比之下，游離 CDDP 和負(fù)載 CDDP 的水凝膠組的腫瘤生長(zhǎng)得到有效抑制。值得注意的是，負(fù)載CDDP的水凝膠的抑制作用可以通過將劑量增加到15 mg/kg來進(jìn)一步提高，TIR顯著提高了86.6%。此外，通過監(jiān)測(cè)小鼠體重來評(píng)估治療的全身毒性。結(jié)果表明，即使 CDDP 劑量達(dá)到 15 mg/kg，用負(fù)載 CDDP 的水凝膠治療的小鼠仍保持穩(wěn)定的體重，表明基于水凝膠的治療的全身毒性較低（圖 5B）。進(jìn)行H＆E染色以評(píng)估各組中腫瘤和主要器官的組織學(xué)特征。如圖5C所示，在PBS組的腫瘤組織中觀察到緊密堆積的腫瘤細(xì)胞，表明腫瘤快速生長(zhǎng)。化療藥物治療后，細(xì)胞密度下降，出現(xiàn)不同程度的壞死區(qū)。另一方面，載有CDDP的水凝膠組動(dòng)物的主要器官未觀察到組織病理學(xué)變化。這證實(shí)了通過從腫瘤部位的水凝膠局部和持續(xù)釋放 CDDP 進(jìn)行治療的低毒副作用。相比之下，游離 CDDP 引起明顯的腎毒性，表現(xiàn)為腎囊腔收縮 [3]。
小結(jié)：
在本研究中，通過 PLG-Norb 和 4aPEG-T 之間的 iEDDA 反應(yīng)開發(fā)了一種可注射的聚氨基酸水凝膠，用于 CDDP 的局部遞送。快速和生物正交的點(diǎn)擊反應(yīng)使我們能夠制備具有不同機(jī)械性能的水凝膠。PLG 的羧基用于與 CDDP 形成聚合物 - 金屬絡(luò)合，延長(zhǎng)釋放曲線。對(duì)于攜帶 MCF-7 異種移植瘤的小鼠的體內(nèi)治療，由于腫瘤部位局部、持續(xù)的 CDDP 釋放，單次瘤周注射負(fù)載 CDDP 的水凝膠表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤功效和降低的全身毒性。此外，點(diǎn)擊水凝膠具有較小的炎癥反應(yīng)和良好的體內(nèi)穩(wěn)定性，是有吸引力的長(zhǎng)效緩釋材料?？傮w而言，可注射點(diǎn)擊聚氨基酸水凝膠顯示出作為局部、持續(xù)遞送抗腫瘤藥物平臺(tái)的巨大潛力。
參考文獻(xiàn)：
[1] Wang, D.; Lippard, S.J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat. Rev. Drug Discov. 2005, 4, 307–320.
[2] Ko, D.Y.; Shinde, U.P.; Yeon, B.; Jeong, B. Recent progress of in situ formed gels for biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 2013, 38, 672–701.
[3] Wu, X.; Wu, Y.; Ye, H.; Yu, S.; He, C.; Chen, X. Interleukin-15 and cisplatin co-encapsulated thermosensitive polypeptide hydrogels for combined immuno-chemotherapy. J. Control. Release 2017, 255, 81–93.
通訊作者簡(jiǎn)介：
賀超良，博士，中國科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所研究員、博士生導(dǎo)師。主要研究方向：（1）仿生智能性高分子水凝膠的設(shè)計(jì)、制備與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用；（2）抗腫瘤藥物局部緩釋載體材料；（3）生物活性水凝膠組織再生與修復(fù)材料。已發(fā)表SCI論文100余篇；其中，以第一/通訊作者在Advanced Materials, National Science Review, Advanced Drug Delivery Reviews, Biomaterials, ACS Applied Materials & Interfaces, Journal of Controlled Release, Biomacromolecules等IF > 5的SCI雜志發(fā)表論文40余篇。全部論文SCI他引總計(jì)5000余次，單篇最高SCI他引500余次，h-index為45。以第一發(fā)明人獲得授權(quán)中國發(fā)明專利17項(xiàng)。2013年入選中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)（2017年入選優(yōu)秀會(huì)員）。2016年獲得國家自然科學(xué)基金“優(yōu)秀青年科學(xué)基金”。擔(dān)任《中國科學(xué)：技術(shù)科學(xué)》和《Science China Technological Sciences》中英文版青年編委。
陳學(xué)思，中國科學(xué)院院士，中科院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所學(xué)術(shù)委員會(huì)常務(wù)副主任，中科院生態(tài)環(huán)境高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)術(shù)委員會(huì)副主任，生物高分子研究組組長(zhǎng)，中共吉林省委和吉林省政府評(píng)為吉林省高級(jí)專家，享受政府特殊津貼。曾榮獲中國科學(xué)院科技促進(jìn)發(fā)展一等獎(jiǎng)，中國化工學(xué)會(huì)“第六屆侯德榜化工科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)”，中國化學(xué)會(huì)“贏創(chuàng)化學(xué)創(chuàng)新獎(jiǎng)”2014年 ，中國石油和化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會(huì)技術(shù)發(fā)明獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)，“十一五”國家科技計(jì)劃執(zhí)行突出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)，長(zhǎng)春高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)管委會(huì)評(píng)為“自主創(chuàng)新十強(qiáng)企業(yè)”經(jīng)營者，中國化學(xué)會(huì)高分子科學(xué)論文創(chuàng)新獎(jiǎng)，長(zhǎng)春高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)管委會(huì)評(píng)為科技創(chuàng)業(yè)先進(jìn)個(gè)人，吉林省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)，世界華商創(chuàng)新獎(jiǎng)“聚乳酸生物可降解材料”，國家杰出青年科學(xué)基金。長(zhǎng)期從事高分子化學(xué)研究，設(shè)計(jì)與合成高旋光純度的聚乳酸和聚氨基酸兩大類聚合物，具體從事生物降解醫(yī)用高分子材料與器件、組織工程支架和藥物緩釋載體、聚乳酸和聚ε-己內(nèi)酯綠色材料產(chǎn)業(yè)化等方向的研究與開發(fā)工作。開展了PEG-g-聚谷氨酸/順鉑抗腫瘤納米藥物的制備及其應(yīng)用研究。同浙江海正集團(tuán)合作實(shí)現(xiàn)了1.5萬噸聚乳酸產(chǎn)業(yè)化，技術(shù)水平達(dá)到了國際領(lǐng)先。組建了長(zhǎng)春圣博瑪生物材料有限公司，獲得了可吸收骨折內(nèi)固定釘和板CFDA兩個(gè)注冊(cè)證（III類）。發(fā)表SCI學(xué)術(shù)論文700余篇，SCI他引2萬余次，h-指數(shù)為83。授權(quán)專利260余項(xiàng)。近年來，主持國家自然科學(xué)基金基礎(chǔ)科學(xué)中心項(xiàng)目及多項(xiàng)國家重點(diǎn)和重大科技項(xiàng)目。
