蛋白質和核酸之間直接和協調相互作用的復雜網絡在許多細胞過程的調節中至關重要，例如基因表達、DNA 復制或 DNA 修復?？梢栽谔烊蝗旧|環境中詢問這些相互作用網絡的穩健方法是了解潛在分子機制的關鍵。目前盡管有一些成功的例子，但相對緩慢的標記動力學、毒性和工程融合蛋白的大小可能會阻礙其適用性和空間分辨率。
相比之下，小分子交聯劑的光活化允許精確控制反應和更短的標記時間，以提供相對較低的背景結合和良好的空間和時間分辨率。在基于親和力的蛋白質分析中，小分子與光交聯劑相連，后者介導原位與細胞蛋白質靶標的不可逆結合，然后通過定量蛋白質組學進行表征。然而，迄今為止，此類方法已被用于繪制藥物或小分子片段的直接蛋白質相互作用物，而不是相互作用網絡。因此，非常需要繞過這些限制并提供特定功能基因組位點蛋白質相互作用的更全面視圖的新策略。
DNA G-四聯體 (G4s) 是非規范的四鏈核酸結構，在某些富含 G 的序列中包含堆疊的 G-四聯體。DNA G4s 已被證明存在于人類細胞中，它們的形成在活細胞中是動態的。多種蛋白質，如解旋酶、轉錄因子和表觀遺傳調節劑，已被證明在體外與 DNA G4 相互作用。
成果簡介
鑒于此，劍橋大學Shankar Balasubramanian等人報告了一種共結合介導的蛋白質分析 (co-binding-mediated protein profiling, CMPP) 方法，用于研究活細胞中的 DNA G4 相互作用組學。成果發表在Nature Chemistry上，并作為該期封面文章！
圖|CMPP 示意圖
探針設計
在細胞中結合多種 G4 DNA 靶結構的小分子可以被功能化，以允許在其天然環境中以最小的擾動繪制 G4 相互作用蛋白。該探針設計基于吡啶抑制素 (PDS)，這是一種高度 G4 選擇性的小分子配體，已廣泛用于靶向細胞中的 DNA 和 RNA G4。之前研究表明，PDS 衍生物和蛋白質可以在體外同時結合 G4，這成為檢測共結合蛋白的有前途的分子支架。
研究人員制備了兩種 G4 配體探針，photoPDS-1 (1) 和 photoPDS-2 (2)，通過將 PDS 連接到點擊炔柄和一個光反應性脂肪族二氮嗪基團上，該基團小且具有優異的化學穩定性、光標記效率和低背景結合。探針 1 有一個短的雙碳接頭，探針 2 有一個雙單元聚乙二醇較長的接頭（12 個原子），可以探測距 G4 結合位點不同距離的蛋白質。此外，還準備了一個缺乏 G4 結合部分的可光活化對照 3。
結果顯示，1 和 2 表現出與不同 G4 結構的強選擇性結合。相比之下，3 沒有表現出明顯的 G4 結合。
圖|體外共結合介導的 G4 結合蛋白的鄰近捕獲
可結合多種蛋白
使用該方法，研究人員確定了數百個 G4 相關蛋白，其中一些是已知的 G4 結合劑，而許多以前沒有描述過。幾種新的 G4 結合蛋白分別通過體外試驗進行了驗證，并證明是特異性的、高親和力的 G4 結合蛋白。鑒于它們在生物過程中的獨特特性和各種功能，這些蛋白質可能在內源性G4形貌和G4生物學的調節中發揮不同的關鍵作用。
蛋白質 SMARCA4 是染色質重塑復合物的一部分，使用基因組 ChIP-seq 方法進一步跟蹤，以證明 SMARCA4 確實與已檢測到 G4 結構的基因組位點有實質性結合。這一結果證實了該 CMPP 方法確實識別了與細胞染色質中 G4 結構結合的蛋白質，特別是在基因啟動子上，并且還暗示 SMARCA4-G4 相互作用可能對轉錄控制很重要。涉及蛋白質敲低或過表達以及 G4 ChIP-seq 的進一步實驗可能最終有助于更詳細地闡明相關機制。
圖|人類細胞中 G4 相互作用組的分析
小結
總的來說，該化學方法表明，它可以為活細胞中核酸結構特征相互作用蛋白的全局定位提供一種無偏策略。雖然這項研究主要集中在DNA-G4相互作用，但研究人員也發現了一些被注釋為RNA結合蛋白的候選基因。PDS可以以相似的親和力結合DNA和RNA G4s，因此，一些已鑒定的蛋白質原則上可能與核RNA G4s結合。設想未來對RNA G4特異性問題的研究可能會采用類似的方法來探索內源性RNA G4蛋白質相互作用。研究人員還設想一般原則將使進一步研究能夠繪制其他核酸結構特征的內源性相互作用組。
參考文獻：
Zhang, X., Spiegel, J., Martínez Cuesta, S. et al. Chemical profiling of DNA G-quadruplex-interacting proteins in live cells. Nat. Chem. 13, 626–633 (2021).
https://doi.org/10.1038/s41557-021-00736-9
