在基因編輯時代之前，引入功能性基因拷貝是成功治療常染色體隱性單基因疾病的唯一可用策略，例如基因治療藥物的市場批準都依賴于這一概念。然而，這很少適用于常染色體顯性疾病，因為顯性負效應只能通過等位基因特異性下調策略來治療。
設計的核酸酶，尤其是由 Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 開創性工作開創的 RNA 引導的 CRISPR-Cas9 系統，可以被視為游戲規則改變者，因為它們為解決潛在缺陷的精確基因組修飾提供了機會。盡管這種方法在動物模型中被證明是有效的，但轉化為人體臨床試驗仍然是全球研究的一個非常活躍的領域。
轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性是一種危及生命的疾病，由錯誤折疊的轉甲狀腺素蛋白 (TTR) 蛋白在神經和心肌細胞中積累為淀粉樣原纖維，最終導致淀粉樣多發性神經病、心肌病或兩者的組合。
NLTA-2001 是一種藥物，它利用 CRISPR-Cas9 系統抑制肝臟中 TTR 的產生。具體來說，具有肝趨向性的脂質納米顆粒 (LNP) 裝載有編碼內切核酸酶 Cas9 的 mRNA 和相應的單向導 RNA（CRISPR-Cas9 系統）。靜脈給藥后，這些顆粒在體內轉導肝細胞并通過 CRISPR-Cas9 活性來抑制TTR，隨后發生非同源末端連接 DNA 修復事件。肝細胞的趨向性是通過載脂蛋白 E 引導的，它介導 LNP 與低密度脂蛋白 (LDL) 受體的結合。
成果簡介
近日，倫敦大學學院Julian D. Gillmore等人報告了使用NLTA-2001給藥的1期臨床研究的結果。表明，單次給藥 NLTA-2001 足以將患者的血清 TTR 水平降低多達 96%，這揭示了這一戰略的效力。這種TTR水平的降低，如果持續的話，有望改善疾病癥狀，并提供強有力的證據證明基因編輯已經在臨床發展中達到下一個水平。該1期臨床研究發表在New England Journal of Medicine (NEJM)雜志上，另外，Nature Medicine對此進行報道。
NLTA-2001作用過程
與已批準用于臨床的其他LNP一樣，NTLA-2001預計將被肝細胞表面表達的低密度脂蛋白（LDL）受體攝取，之后是胞吞和內吞體的形成。LNP分解和內吞體膜破壞后，活性成分（TTR特異性sgRNA和Cas9編碼mRNA）被釋放到細胞質內。Cas9 mRNA分子通過天然核糖體過程翻譯，生成Cas9核酸內切酶。TTR特異性sgRNA與Cas9核酸內切酶相互作用，形成CRISPR-Cas9核糖核蛋白復合物。
Cas9核糖核蛋白復合物通過入核轉運的方式進入細胞核，并在細胞核內識別TTR中非互補DNA鏈上的前間隔序列鄰近基序（PAM）。sgRNA 5'末端的靶基因特異性20個核苷酸序列在靶位點與DNA雙螺旋結合，使CRISPR-Cas9復合物解旋并接近靶基因。Cas9經歷了一系列構象變化和核酸酶結構域（HNH和RuvC結構域）激活，使DNA裂解，并精確靶向由sgRNA互補序列定義的TTR序列。內源性DNA修復機制連接切口末端，有可能引入堿基插入缺失（indel）。插入缺失可能導致功能性靶基因mRNA水平降低（原因是錯義或無義突變減少了全長mRNA的數量），最終導致靶蛋白水平降低。
圖|NTLA-2001的作用機制（自NEJM中文版）
肝臟作為靶組織的優勢
當前該研究為將基因治療方法推向更高水平奠定了基礎，因為基因編輯從離體基因治療轉向體內基因治療。使用肝臟作為治療靶組織和 TTR 作為靶基因是實現體內基因編輯臨床第一步的明智之舉，因為肝臟相對容易通過攜帶載脂蛋白 E 的 LNP 靶向，并且 TTR 幾乎僅在肝細胞中表達（> 99％）。此外，患病等位基因和健康等位基因的破壞不會產生重大的病理后果，因為野生型 TTR 的唯一已知功能是視黃酸的轉運，其損失可以通過補充維生素 A 來克服。
圖|基于 CRISPR–Cas9 的基因編輯的體內和體外策略
展望：
展望未來，考慮到個性化離體基因治療面臨的挑戰，體內基因治療以及“現成的”離體修飾基因治療藥物被認為是為所有有需要的患者提供基因治療的可行選擇。除了高質量和與人類白細胞抗原相容的供體細胞的可用性及其生產所需的時間之外，離體基因治療策略還依賴于具有移植經驗和符合良好生產規范的細胞修飾設施的專業治療中心。
而體內基因治療則解決了這些問題，并且可能會降低此類策略的總體成本，這反過來又會影響這些將改變醫學領域的創新治療方案的可用性。實現這一目標的先決條件是提供量身定制的載體系統，該系統能夠準確、高效和安全地將治療性物質輸送到所選的靶細胞中。針對非病毒載體（例如，使用 LNPs）和病毒載體的一系列策略已經成功開發，并且正在不斷努力。盡管在提高靶細胞轉導效率方面的結果特別有希望，但細胞表面靶向實驗的結果表明，原則上可以實現無脫靶效應的靶向遞送，但這取決于細胞類型特異性受體。目前的研究已經利用這一策略，通過靶向 LDL 受體來提高 mRNA 遞送至肝細胞的效率。
盡管目前的數據處于研究的早期階段（即治療后 28 天），但在療效和缺乏治療相關的嚴重不良事件方面，初步結果令人印象深刻。然而，仍然需要進一步的數據來充分表征這種基因治療方法的有效性、持久性和安全性。
參考文獻：
1. Gillmore JD, Gane E, Taubel J, et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med 2021;385:493-502.
https://doi.org/10.1056/NEJMoa2107454
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3. Büning, H., Schambach, A. A first step toward in vivo gene editing in patients. Nat Med (2021).
https://doi.org/10.1038/s41591-021-01476-6
