第一作者：Huawei Wang, Christina N. Alarcón
通訊作者：Richard L. Klemke
通訊單位：加利福尼亞大學(xué)
研究背景：
如何將藥物有效遞送至疾病部位一直是科研人員的研究熱點(diǎn)。高效遞送藥物至疾病部位能夠極大提高藥物利用度并降低對機(jī)體產(chǎn)生的副作用。細(xì)胞因子（如IL-10、 IL-12）具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，在炎癥治療方面發(fā)揮著重要作用，但是這些細(xì)胞因子在循環(huán)中的半衰期短，在靶組織中的生物利用度低，以及與全身給藥相關(guān)的不良反應(yīng)阻礙了其在臨床進(jìn)一步推廣。
無細(xì)胞載體憑借其高生物相容性，高變形性，來源廣等優(yōu)點(diǎn)迅速成為藥物遞送載體選擇的寵兒。目前已知的無細(xì)胞載體主要包含各種細(xì)胞來源的外泌體，細(xì)胞膜擠出囊泡，細(xì)菌囊泡，紅細(xì)胞等，他們在癌癥、炎癥等相關(guān)疾病治療藥物遞送方面發(fā)揮著重要作用，但其在臨床使用過程中也暴露出疾病部位靶向不足，以及在循環(huán)中泄露的治療藥物會造成嚴(yán)重副反應(yīng)，這些不利因素嚴(yán)重干擾無細(xì)胞載體在臨床中的進(jìn)一步推廣。除了無細(xì)胞載體外，科研人員也嘗試?yán)萌?xì)胞進(jìn)行遞送藥物，利用細(xì)胞的相關(guān)生物功能，靶向至疾病部位，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞利用趨化因子濃度梯度向炎癥組織歸巢，將藥物遞送至炎癥部位。但是隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)盡管骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞具有天然的疾病趨向特性，但靜脈注入后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對靶組織的歸巢不一致且不充分。因此結(jié)合無細(xì)胞載體與真核細(xì)胞載體兩者的優(yōu)勢有望打造出一種高效的炎癥靶向遞藥載體。
成果簡介：
研究人員對人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程化修飾，使之表達(dá)趨化因子受體和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合分子，然后通過密度梯度離心去除細(xì)胞核，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種去除細(xì)胞核的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞是靶向給藥的有效載體。
去核細(xì)胞既不能增殖，也不能永久性地移植到宿主體內(nèi)，但仍能保留細(xì)胞器以產(chǎn)生能量和蛋白質(zhì)，通過整合素調(diào)節(jié)粘附到發(fā)炎的內(nèi)皮細(xì)胞上，并積極地響應(yīng)病變組織建立的趨化因子梯度。在急性炎癥和胰腺炎的小鼠模型中，系統(tǒng)給藥的去核細(xì)胞表達(dá)兩種類型的趨化因子受體和內(nèi)皮粘附分子，增強(qiáng)了抗炎細(xì)胞因子向病變組織的傳遞（相對于未修飾的基質(zhì)細(xì)胞和來源于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的外泌體），減輕炎癥，改善疾病病理進(jìn)程。去核細(xì)胞保留了細(xì)胞的大部分功能，并獲得了無細(xì)胞遞送系統(tǒng)的載貨特性，因此代表了一種多功能輸送載體和治療系統(tǒng)。
要點(diǎn)1. 去核間充質(zhì)細(xì)胞（貨細(xì)胞）保留母細(xì)胞重要細(xì)胞器以及相應(yīng)細(xì)胞功能
研究人員利用基因工程技術(shù)首先使人間充質(zhì)干細(xì)胞（hT-MSC）表達(dá)趨化因子受體以及內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合分子，然后利用密度梯度離心獲取去核細(xì)胞-貨細(xì)胞（Cargocytes）（圖1a）。相比于hT-MSC，Cargocytes在細(xì)胞染色中未觀察到核酸，表明其已經(jīng)完全去除掉細(xì)胞核，并且在尺寸上，Cargocytes比全細(xì)胞更小（圖1b-d）,由于已經(jīng)去掉細(xì)胞核，因此相比于全細(xì)胞，Cargocytes并沒有增殖能力（圖1e）。另外研究人員發(fā)現(xiàn)全細(xì)胞以及Cargocytes的培養(yǎng)基上清中都可以分離得到外泌體，并且兩者都具有相似的杯狀結(jié)構(gòu)，兩種外泌體在粒徑分布以及電位方面并沒有顯著性差異（圖1f-h）。在導(dǎo)入GFP-mRNA后，兩者都表達(dá)出GFP蛋白，并且在熒光強(qiáng)度方面并沒有顯著性差異（圖1i-k），說明Cargocytes具有完整的翻譯功能。
圖1. Cargocytes具有完整的細(xì)胞功能
要點(diǎn)2. Cargocytes具有趨化活性，能更好地通過狹窄通道
首先研究人員利用Boyden小室實(shí)驗(yàn)以及微流體壓縮通道遷移實(shí)驗(yàn)表明，在FBS密度梯度下，hT-MSC以及Cargocytes均表現(xiàn)出FBS密度梯度趨化特性，但是有趣的是，在微流體壓縮通道遷移實(shí)驗(yàn)中，相比于hT-MSC，Cargocytes表現(xiàn)出更好地遷移效果，原因主要是由于去除細(xì)胞核后，Cargocytes剛性降低，使其具有更強(qiáng)的變形能力，因此賦予其更好的遷移能力（穿過更窄的通道）（圖2a-e）。研究表明，與親代間充質(zhì)干細(xì)胞相比，貨細(xì)胞保留了固有的趨化活性、基底膜浸潤，并具有更好的變形能力，這可能更好地促進(jìn)通過體內(nèi)的小毛細(xì)血管、內(nèi)皮細(xì)胞層或間質(zhì)空間。另外研究人員利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入hT-MSCs 細(xì)胞不表達(dá)的外源性趨化因子受體-CXCR4，目前，CXCR4/SDF-1α趨化性遷移通路已被成功應(yīng)用于臨床。研究人員通過慢病毒感染和藥物選擇，構(gòu)建了具有CXCR4表達(dá)的hT-MSCs（hT-MSCCXCR4），并制備出表達(dá)CXCR4的CargocytesCXCR4，實(shí)驗(yàn)表明，再給予APC-CXCR4染色后，發(fā)現(xiàn)改造后的hT-MSCsCXCR4以及CargocytesCXCR4均能穩(wěn)定表達(dá)CXCR4受體，并且在SDF-1α趨化因子梯度下表現(xiàn)出一定的遷移能力，并且CargocytesCXCR4表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移能力（圖2f-g）。
圖2. 貨細(xì)胞具有趨化活性并且有更強(qiáng)的遷移能力
要點(diǎn)3. 工程化Cargocytes能與黏附分子特異性結(jié)合
除了修飾趨化因子受體外，研究人員將內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（PSGL-1）修飾在hT-MSCs（hT-MSCsPSGL-1）上，并制備CargocytesPSGL-1。流式細(xì)胞術(shù)顯示，CargocytesPSGL-1在48小時后依舊穩(wěn)定表達(dá)PSGL-1，并且依舊能夠與E/P型選擇素結(jié)合。在干細(xì)胞以及免疫細(xì)胞向炎癥部位滲透的過程中，內(nèi)皮黏附分子與選擇素特異性結(jié)合是“固定”細(xì)胞的第一步，此外局部細(xì)胞因子誘導(dǎo)的整合素（如VLA-4）的高效激活是血管內(nèi)皮細(xì)胞完全停滯和隨后導(dǎo)致外滲所必需的。通過CXCR4-SDF-1α激活的VLA-4是不需要進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄的。研究表明，在基于SDF-1α刺激后，相比于未修飾CXCR4的Cargocytes，修飾后的CaegocytesCXCR4能夠更好地激活VLA-4（圖3b-c），此外，研究人員將三種趨化因子受體（CCR2, CXCR4 and PSGL-1/FUT-7）同時修飾到MSCTri-E，并優(yōu)選出最佳的一種修飾后的細(xì)胞（(MSCTri-E C19），并制備得到CargocytesTri-E C19，在利用HUVES以及TNF-α構(gòu)建的體外炎癥模型中，發(fā)現(xiàn)MSCTri-E以及CargocytesTri-E C19均具有良好的炎癥靶向性（圖3d,e）。
圖3. 基因工程化修飾的Cargocytes具有與黏附分子相互作用的能力
要點(diǎn)4. 基因工程化修飾的Cargocytes能夠主動、特異性靶向至炎癥組織-耳朵
研究人員利用耳部炎癥模型來考察CargocytesTri-E C19（前期研究優(yōu)選的Cargocytes）炎癥部位主動靶向能力。經(jīng)靜脈注入后，首先通過肺毛細(xì)血管，再遷移至炎癥耳部，因此研究人員通過DiD和RFP雙標(biāo)的MSC以及對應(yīng)的Cargocyte來追蹤其在肺部組織以及耳部聚集程度。此外，研究人員認(rèn)為3D懸浮培養(yǎng)的MSC較2D貼壁培養(yǎng)的MSC體積大，那么它們所產(chǎn)生的Cargocytes是否也會出現(xiàn)相同的趨勢，因此選取2D以及3D培養(yǎng)的MSC以及對應(yīng)制備的Cargocytes進(jìn)行肺截留考察，結(jié)果顯示，3D培養(yǎng)的MSC在肺部的蓄積量明顯低于2D培養(yǎng)的MSC細(xì)胞，并且與2D培養(yǎng)的MSC所制備的Cargocytes具有近似的蓄積量，說明3D培養(yǎng)的MSC在細(xì)胞伸縮性以及剛性等方面與2D-MSC來源的Cargocytes類似，而3D-MSC制備的Cargocytes則具有最低的肺部蓄積量（圖4a），這個結(jié)果也延伸出某些細(xì)胞在3D懸浮培養(yǎng)的時候更接近其在體內(nèi)的成長狀態(tài)。如圖4b所示，研究人員也研究了修飾以及未修飾MSC及其制備的Cargocytes對炎癥部位的歸巢效果，研究表明，相對于母細(xì)胞（MSC），對應(yīng)的Cargocytes都具有更強(qiáng)的歸巢能力，三組同時比較時，修飾三種趨化因子受體的CargocytesTri-E C19顯示出最強(qiáng)的歸巢能力，相對于炎癥耳部（Right ear），未發(fā)炎的耳部（Left ear）幾乎無分布，類似結(jié)果在離體影像結(jié)果中也得到驗(yàn)證（圖4c，d）。
圖4. 基因工程化修飾的Cargocytes能夠主動歸巢之炎癥部位
要點(diǎn)5. Cargocytes能分泌細(xì)胞因子以減輕組織炎癥和損傷
前期工作已驗(yàn)證外源性導(dǎo)入的GFP-mRNA能夠在Cargocytes內(nèi)表達(dá)，因此，研究人員將IL10-mRNA導(dǎo)入MSC以及Cargocytes內(nèi)，靜脈注入后，考察炎癥部位IL-10水平以及炎癥緩解情況。如圖5a所示，相比于對照組（hT-MSC only），IL-10-mRNA修飾的MSC以及Cargocytes的培養(yǎng)基上清在72h內(nèi)均有穩(wěn)定持續(xù)的IL-10濃度，同時利用相應(yīng)的培養(yǎng)基上清與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，他們對應(yīng)的培養(yǎng)基均能是小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞內(nèi)Stat3磷酸化，說明對小鼠炎癥性巨噬細(xì)胞具有生物調(diào)節(jié)活性（圖5b）。此外對小鼠炎癥耳部的IL-10水平檢測、耳部切片以及耳部厚度和相關(guān)炎癥因子表達(dá)情況的考察，得出，IL-10-mRNA修飾的Cargocytes在具有炎癥部位歸巢能力的同時亦能有效緩解組織炎癥及損傷（圖5c-f）。
圖5. 基因工程修飾Cargocytes能有效地將生物活性IL-10輸送到發(fā)炎的耳朵并改善局部炎癥
要點(diǎn)6. 基因工程修飾Cargocytes有效緩解小鼠蛙皮素誘導(dǎo)的急性胰腺炎
研究人員利用蛙皮素構(gòu)建小鼠急性胰腺炎模型后，通過靜脈注入IL-10-mRNA修飾的CargocytesTri-E C19、對應(yīng)的MSC細(xì)胞以及對應(yīng)來源的外泌體，來考察炎癥部位IL-10表達(dá)水平，以及相對應(yīng)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄情況，最終通過切片水平比較得出IL-10- CargocytesTri-E C19能夠有效緩解蛙皮素誘導(dǎo)的小鼠胰腺炎（圖6）。
圖6. 基因工程化修飾的CargocytesTri-E C19能夠有效緩解蛙皮素誘導(dǎo)胰腺炎
總結(jié)：
研究人員開發(fā)的這種Cargocytes在保留細(xì)胞大部分生物功能的同時又具有無細(xì)胞載體所表現(xiàn)出的相應(yīng)特性，在基因工程化修飾后，能主動、高效地靶向炎癥部位，其在相應(yīng)炎癥模型所表現(xiàn)出的優(yōu)勢可能為炎癥治療帶來革命性的進(jìn)展。
參考文獻(xiàn)：
Wang, H., Alarcón, C.N., Liu, B. et al. Genetically engineered and enucleated human mesenchymal stromal cells for the targeted delivery of therapeutics to diseased tissue. Nat Biomed Eng (2021).
DOI: 10.1038/s41551-021-00815-9
https://doi.org/10.1038/s41551-021-00815-9
