第一作者：Yang Yang
通訊作者：張凡
通訊單位：復旦大學
研究背景
近紅外二區熒光多重成像技術可以同時對活體深層組織內的兩個或者多個生物過程進行定性和定量的研究，因此，對于科研人員更好的理解疾病的發生機制、進行藥物的篩選以及臨床上的精確診斷具有重要的意義。然而，由于缺乏在水溶液中具有完整吸收光譜以及良好光譜分離的高亮度近紅外二區染料，活體深層組織下的近紅外二區熒光多重成像具有很大的挑戰性。
成果簡介
近日，復旦大學張凡教授團隊構建了一系列長波長的七甲川菁染料，并通過反離子配對策略有效增強了染料在水溶液中的光物理學性質。最后，通過結合反離子配對的染料和激發波長相匹配的激光器構建了近紅外二區激發雙色成像系統，并將該系統成功地用于同時成像小鼠的血液循環系統和代謝器官、腫瘤和腫瘤附近的血管系統、小鼠后肢的淋巴系統和血管系統。這是首次在活體深層組織內實現近紅外二區激發和近紅外二區發射的熒光多重成像。相關論文發表在Angew上，復旦大學化學系博士后楊陽和孫彩俠博士（現為新加坡南洋理工大學博士后）為文章的共同第一作者；復旦大學張凡教授、王尚風研究員為通訊作者。該研究工作得到了復旦大學化學系、聚合物工程國家重點實驗室、上海市分子催化和功能材料重點實驗室、國家重點研發項目、國家自然科學基金委員會、上海市科學技術委員會等機構與項目的大力支持。
摘要圖
【圖文詳解】
圖1：團隊基于七甲川菁染料為母體設計了九種菁染料分子（命名為HC）。HCs染料是以吡喃或噻喃雜環為端基，中間以甲川共軛鏈相連，可以增加分子內的推拉電子效應，促使染料的波長紅移。同時，當染料的雜原子由氧變成硫時，硫原子對核外電子的束縛能力減弱，導致染料的離域能力增強，迫使染料的波長紅移。而且，端基五元橋環結構的引入不僅可以增加染料的光穩定性和化學穩定性，抑制染料的旋轉，提高量子產率，而且還可以提供超共軛效應進一步迫使染料的波長紅移。最后，通過在端基苯環上的不同位點修飾給電子的甲氧基，對染料的波長進行更細微的調節。通過對染料光物理學性質的研究發現其最大吸收/發射波長都位于近紅外二區（1000-1700 nm），λmax，abs在1180-1312 nm的波長范圍內可調，λmax，em在1222-1376 nm的波長范圍內可調。
圖1.（a-d）HCs染料的設計思路和分子結構；（e）HCs染料的合成路線；（f）部分HCs染料在DCE中的歸一化吸收光譜；（g）部分HCs染料在DCE中的歸一化發射光譜。
圖2：首先，為了闡明雜原子和甲氧基取代對HCs染料的電子和幾何性質的影響，團隊對染料進行了密度泛函理論（DFT）和含時密度泛函理論（TDDFT）計算。結果表明所有HCs染料的（S0→S1）能級與λmax，abs的變化趨勢密切相關，而且染料都具有平面的多甲川骨架，但末端的雜環是非平面的。
圖2.（a）計算出HCs染料的最高占據分子軌道（HOMOs）、最低未占據分子軌道（LUMOs）和S0–S1激發能（ΔE）；（b）HCs染料的優化基態（S0）幾何結構。
圖3：隨后，團隊發現，和已經報道的近紅外二區菁染料類似，HCs膠束在水溶液中表現出吸收光譜的衰減和變寬，以及熒光猝滅，這通常可以由ACQ效應和不對稱偶極結構的形成來解釋。為了解決這個問題，團隊引入反離子配對策略，使用體積龐大的疏水反離子作為空間間隔物來阻止染料的聚集，也可以作為軟離子來削弱極化。結果表明，反離子配對的染料在水溶液中表現出優秀的光物理性質，證明了其在生物成像方面具有潛在的應用價值。
圖3.（a）HCs膠束和HC/F5-TPBs膠束的光物理性質示意圖；（b，c）HC1222和HC1342在DCE中的吸收光譜，以及負載1 wt% HCs、HC/TPBs和HC/F5-TPBs的膠束在水中的吸收光譜;（d）吸收光譜的峰肩比；（e）反離子（F5-TPB）交換前后染料膠束的亮度比較；（f）HC1222/F5-TPB和HC1342/F5-TPB膠束歸一化的熒光強度與染料負載量的關系；（g）ICG（水中）、ICG-FBS復合物、IR1061膠束、HC1222/F5-TPB膠束和HC1342/F5-TPB膠束在808 nm激光照射（600 mW/cm2）下的歸一化熒光強度。
圖4：進一步，團隊為了評估反離子配對的HCs染料的近紅外二區激發成像性能，分別研究了模擬生物組織和真實生物組織中的光學穿透性能以及活體成像性能。結果表明反離子配對的染料膠束擁有更高的亮度。此外，小鼠的全身血管成像結果證明了反離子配對策略提高染料成像性能的有效性，為近紅外二區激發的多重生物成像做好了準備。
圖4.（a）HC1342/F5-TPB膠束在脂肪乳劑中的穿透實驗示意圖；（b，c）HC1342/F5-TPB膠束覆蓋2 mm小鼠肌肉組織后的成像示意圖；（d-k）小鼠大腦、背部、后肢和腹部血管成像示意圖。
圖5：最后，團隊通過結合反離子配對的染料和激發波長相匹配的激光器構建了近紅外二區激發雙色成像系統，并將該系統成功地用于同時成像小鼠的血液循環系統和代謝器官、腫瘤和腫瘤附近的血管系統、小鼠后肢的淋巴系統和血管系統。
圖5.（a）HC1222/F5-TPB和HC1342/F5-TPB的歸一化發射光譜以及1200-1300 nm通道（紅色）和1450-1700 nm（青色）通道的偽彩色圖像；（b）代謝系統雙色成像的示意圖；（c）腫瘤小鼠的雙色成像示意圖；（d）沿c中黃色虛線的橫截面熒光強度分布；（e）淋巴管和后肢血管的雙色成像示意圖；（f）沿e中黃色虛線的橫截面熒光強度分布。
【總結】
總之，團隊設計合成了九個具有近紅外二區發射的七甲川菁染料，并通過反離子配對策略增強了染料在水溶液中的光物理學性質。通過結合反離子配對的染料和激光器構建了近紅外二區激發雙色成像系統，并將該系統成功地用于同時成像小鼠的血液循環系統和代謝器官、腫瘤和腫瘤附近的血管系統、小鼠后肢的淋巴系統和血管系統，首次在活體深層組織內實現近紅外二區激發和近紅外二區發射的熒光多重成像。該研究拓展了熒光多重成像的能力，為活體深層組織內的生物醫學成像提供了新的機會。
參考文獻
Yang Yang, et al. Counterion-paired Bright Heptamethine Fluorophores with NIR-II Excitation and Emission Enable Multiplexed Biomedical Imaging. Angew.
DOI：10.1002/anie.202117436
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202117436
通訊作者信息：
張凡，教授，博士生導師，國家杰出青年基金獲得者，中組部青年拔尖人才。2008年在復旦大學化學系博士畢業后赴美國加州大學圣塔芭芭拉分?；瘜W與生物化學系進行博士后研究。2010年加入復旦大學化學系，2012年協調成立復旦-陶氏化學聯合研究中心，任研究中心副主任，2013年底開始任復旦大學化學系教授。2020年成立上海市生物醫學檢測試劑工程研究中心，任中心主任。張凡教授主要從事于稀土近紅外熒光納米探針和有機分子探針的設計合成以及生物醫學診斷分析。已發表SCI論文100余篇，其中包括Nat. Maters.（自然-材料）, Nat. Nanotechnol.（自然-納米技術）, Nat. Commun（自然-通訊）等Nature系列論文10篇，他引2萬余次，H index 80，累計超過30篇論文入選ESI高被引論文，2018-2021入選全球高被引學者。撰寫出版英文專著2部。獲得2020年度國家自然科學一等獎（第四完成人）、2019年度教育部自然科學一等獎、侯德榜化工科技獎、上海市科技進步獎等獎、上海市青年英才科技獎等榮譽。受邀在國際會議上作大會邀請報告30余次，同時擔任國際期刊Frontiers in Chemistry (Nanoscience Section)執行主編。
課題組主頁：http://nanobiolab.fudan.edu.cn/
