身處后疫情時代，對于疾病的帶來的苦痛，我們每個人都深有體會。對于疾病而言，我們一直在力圖實現早預防、早發現、早治療。早篩的概念其實在國內早在2005年就被提出了，但是也只是近十年內才高速發展起來。
有多少的家庭被腫瘤摧毀，一紙檢測報告所有的字眼都比不上晚期二字，如同晴天霹靂般無法相信早期和中期去哪里了？有調查顯示，美國每年有幾十萬不到一百萬新發的癌癥病人，而中國是300萬人，2015年甚至達到了430萬新發癌癥案例，這個數據是美國的4倍。不可思議的是，在美國50%癌癥發現是中晚期，而在中國是80%。其實有幾乎九成的腫瘤在早期發現的話是可以治療的，所以疾病的早篩，其重要性不言而喻。
其實近些年中，疾病的早篩也在飛速發展著。從分子生物學中的蛋白標志物、再到基因學中的易感基因與疾病家族史的篩查、再到細胞水平上的循環腫瘤細胞用于早篩與復發預防、最后到近些年比較火的腫瘤外泌體用于早篩開發。這些早期腫瘤的馬腳在被我們一步步的揪出來。同時，檢驗與影像醫學也在迅速發展著，為早篩開發出更多更優異的檢測技術，膠體金、免疫熒光、流式細胞術、巢式PCR等等。
近日南洋理工大學化學與生物工程學院的浦侃裔團隊與浙江大學醫學院附屬第一醫院合作，共同開發了一種可以通過腎臟清除的多熒光團納米傳感器。這是一種泛用性納米平臺，通過靜脈注射與特異酶靶向，結合體內成像和尿液分析，可以實現小型腫瘤與免疫排斥反應的超靈敏檢測，推動了早篩領域的進一步發展。
APNs結構功能設計：
作者團隊報告了可激活的多熒光團納米傳感器（APNs）的設計，具有生物標志物觸發的腎臟清除和熒光反應，用于非侵入性近紅外熒光（NIRF）體內成像和尿液分析。APNs包括三個關鍵構建塊：蛋白酶反應肽段，級聯自毀單元和具有腎清除部分和/或靶向部分的熒光團單元。熒光團單元與自毀單元連接以形成聚合物主鏈，其蛋白酶反應肽段與自毀單元苯胺側鏈相連接。熒光團單元的疊氮化物基團與腎清除單元HPβCD或cRGDfK進一步偶聯，分別得到APNC和 APNG。在內在狀態下，APNs是非熒光的，因為熒光團單元的酚基基于籠狀結構被抑制了電子供體能力。而在激活狀態下，蛋白酶切割蛋白酶反應肽段并誘導級聯自毀單元降解以解聚APNs的主鏈，釋放腎可清除的熒光團片段用于NIRF成像和尿液分析。
在原位肝癌，皮下結直腸癌和急性肝同種異體移植排斥反應的嚙齒動物模型中測試APNs。選擇兩種蛋白酶，組織蛋白酶B（CatB）和顆粒酶B（GzmB），分別與腫瘤進展和同種異體移植物排斥反應中的淋巴細胞活化有關，作為構建APNC和 APNG的生物標志物。
圖 APNs的構建示意圖
APNs物理性能與生物代謝表征：
APNs的疏水性熒光團骨架和蛋白酶反應肽段的親水性使其具有兩親性，因此它們在具有球形形態的水溶液中自發組裝成納米顆粒。APNC和 APNG平均流體動力學直徑為180和170 nm。APNC和 APNG具有幾乎相同的光學特性，在600nm處具有最大吸收，并且最初在PBS中是非熒光的。響應于它們各自的蛋白酶后，APNs的吸收發生了變化，在700nm處出現了峰并且熒光強度增加了約11倍。
研究了APNs和降解片段的藥代動力學。降解片段CyCD的有效腎清除率歸因于其高親水性和分子量遠低于腎小球濾過臨界值（<50kDa）。CyCD（CyRGD）的腎臟清除效率與糞便排泄效率的比較分別為91±3.0%與1.9±1.0%，即降解片段主要通過尿液排出體外。APNs的從注射后12天開始，它們在所有主要器官中完全檢測不到，表明它們完全從體內清除。
研究APNs的生物分布。相比CyCD主要聚集于腎臟，CyRGD主要積聚在肝臟，膽囊和腸道中。APNs的大尺寸導致它們在肝臟中的積累。此外，組織學染色顯示，所有APNs及其片段都具有很高的生物安全性。
圖 APNs的物理性能表征
圖 APNs的藥代動力學及生物分布表征
原位肝腫瘤早篩應用：
癌癥的早期診斷對于治愈治療和提高生存率至關重要。然而，由于當前方法的敏感性和特異性較低，檢測超小型腫瘤（<2 mm）仍然具有挑戰性。
APNC在原位肝腫瘤模型中評估了腫瘤的實時成像和尿液分析。從LM3細胞植入14天后，靜脈注射APNC后進行縱向成像。注射后6 h肝-背景比（LBR）和KBR達到最大值。在腫瘤植入后3天，當腫瘤體積約為3.4mm時，最大LBR和KBR相對于對照小鼠增加了2.0倍和2.4倍。此外，在腫瘤植入后8 d觀察到小鼠組的信號演變與成像時間的函數相似。
在注射APNC后，通過測量尿液CyCD來檢測腫瘤內CatB水平.相對于對照小鼠，腫瘤植入后3，8和14 d的信號分別增加了1.8倍，3.8倍和7.8倍。尿液CyCD百分比與腫瘤大小密切相關（圖4j）。APNC基于尿液分析的檢測能夠檢測直徑低至~1.9 mm的原位肝腫瘤，與約~1.6 mm的接近皮下CT26腫瘤（見附圖）。臨床肝功能測定的敏感性較低，因為當腫瘤直徑~6.4 mm時，丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）即使在腫瘤植入后14 d也沒有顯著增加。
圖 APNs的原位肝腫瘤早篩應用
免疫介導急性肝炎早篩應用：
實時監測活化的T淋巴細胞的存在對于診斷免疫介導的疾病和實體器官同種異體移植排斥反應至關重要。APNG監測T淋巴細胞活化的性能在凝集素康那瓦林A（Con-A）誘導的急性免疫介導的肝炎小鼠模型中進行測試。
APNG在用Con-A誘導后的不同時間靜脈注射到小鼠體內。NIRF成像顯示，用Con-A治療2 h后，APNG的信號在肝臟和腎臟中接近對照小鼠;然而，在5小時后，信號分別增加了2.4倍和1.9倍，表明APNG在肝臟中被激活，將CyCD釋放到腎臟中。用Con-A處理后7小時和11小時觀察到小鼠組的類似信號演變。
測量尿液CyCD的信號以進行光學尿液分析。治療后5小時（5.5倍）觀察到第一個具有統計學意義的NIRF增強;它在8小時（7.3倍）繼續增加，然后在治療后12小時（5.0倍）下降。與成像數據一致，在給予高劑量CsA時，尿中熒光信號接近背景水平。此外，尿中熒光信號與肝臟GzmB濃度相關。
圖 APNs的免疫介導急性肝炎早篩應用
急性肝同種異體移植排斥反應早篩應用：
原位肝移植是終末期肝病患者的唯一選擇。然而，同種異體移植排斥反應仍然是移植后的主要并發癥。侵入性活檢是常規用于診斷同種異體移植排斥反應和監測免疫抑制藥物治療療效的金標準。該手術可導致繼發性損傷，并且僅提供靜態和局灶性病理狀態。APNG也在在急性肝同種異體移植排斥反應的大鼠模型中進行了評估。
以健康小鼠的移植前尿液信號為基線，移植后3天（3.2倍）觀察到尿CyCD的首次統計學意義NIRF增強，移植后分別增加到4天和6天4.9倍和3.9倍。在Tac治療后，低劑量時信號降低至1.8倍，甚至在高劑量時退退到基線水平。
驗證APNG的信號是否與T細胞同種異體移植物的浸潤程度相關，通過流式細胞術分析不同術后移植細胞毒性T淋巴細胞中GzmB的水平。檢測肝臟中GzmB上調，最早時間點是術后3 d，相對于健康大鼠的增量為4.8倍，與APNG尿液分析結果一致。免疫熒光染色顯示，移植后3 d觀察到肝臟中CyCD的信號，但對于同種移植物大鼠，假手術大鼠或LPS誘導的局部皮膚水腫的大鼠則不然。此外，包括TNF-α，IFN-γ，IL-2，IL-4和IL-6在內的細胞因子在術后2 d顯示出統計學上顯著的增加。但是在，在同種移植，假手術和皮膚水腫大鼠中也觀察到細胞因子的統計學顯著增加，顯示出低特異性。
圖 APNs的急性肝同種異體移植排斥反應早篩應用
小結：
作者團隊以開發了 APNs 平臺，通過體內成像與尿液熒光檢測實現了直徑小至~1.6 mm（皮下結直腸癌）和~1.9 mm（原位肝癌）小型腫瘤的超靈敏檢測。這明顯比許多臨床成像技術更敏感。
在免疫介導的肝炎和急性肝同種異體移植排斥模型中，APNG基于尿液分析被證明與流式細胞術和活檢一樣敏感，但具有非侵入性和動態性的優點。此外，它比包括超聲在內的臨床成像方法更早檢測到T細胞浸潤到肝臟同種異體移植物中。值得強調的是，APNG-基于尿液的分析將急性同種異體移植排斥反應與創傷和局部炎癥區分開來，這在血液檢查中是不可能的。
同時，尿液檢測的開發使得這項技術有著更高的臨床轉化價值，尿液作為一種極其易取的體液，其內的自體生物學指標波動過大一直是限制其應用的枷鎖。此技術使用了腎清除的熒光基團來反應體內某些酶的水平，打造了一種通用納米平臺。可以預期的是，通過更改蛋白酶反應肽段的設計，該平臺可以適應越來越多的生物指標篩查。
參考文獻：
Huang, J., Chen, X., Jiang, Y. et al. Renal clearable polyfluorophore nanosensors for early diagnosis of cancer and allograft rejection. Nat. Mater. (2022).
https://doi.org/10.1038/s41563-022-01224-2
