背景：
在細胞中，RNA具有各種各樣的二級三級結構可以讓它實現多種功能，包括調控基因的表達，催化一些化學反應以及協助蛋白質折疊等等。在RNA納米技術和基于RNA的基因表達調控的基礎之上，近年來已經有許多研究在活細胞中利用多個精心設計的合成 RNA 的組合相互作用的分子計算系統被開發出來。
近日，波士頓大學的Alexander A. Green等人報道一種不受序列約束的多臂RNA結編碼的分子邏輯門控策略用來進行不依賴細胞的診斷策略。其成果發表在Nature biomedical Engineering上。
研究內容：
他們設計了可以響應不同RNA輸入的多臂結結構，該結構具有依據輸入RNA序列獨立實現功能的莖環啟動的RNA激活因子（LIRA）基序。接著他們將這個自組裝的多臂結整合到了被調控基因的上游實現對基因的選擇性調控，下圖展示了他們實現這一策略的基本原理。通過控制莖-環臂的長度和數目，他們成功構建出了“鎖臂（Locked arm）”和“未鎖臂（Unlocked arm）”兩種狀態。“未鎖臂”可直接與輸入的RNA相結合，因而被設計成了“或”門，（如下左圖所示）；“鎖臂”在未被解鎖的時候無法與輸入的RNA結合，故被設計成了“與”門（如下右圖所示）。
輸入的RNA和LIRA的環狀區域的結合會引發核糖體結合位點（RBS）和起始密碼子（AUG）區域打開，進一步會啟動翻譯的過程。具體實現的過程如下a圖所示，輸入的RNA鏈中a區域和LIRA中a*環形區域結合之后，其b區域會與LIRA上方發卡結構的莖部b*區域結合進而會打開其下方一點位置的莖部區域。作者使用NUPACK設計了24種不同序列的LIRA文庫，并基于這些序列構建質粒以在大腸桿菌 BL21 Star DE3 細胞中使用 T7 RNA 聚合酶表達輸入RNA和 LIRA 轉錄物。使用綠色熒光蛋白（GFP）作為報告基因并使用流式細胞術來檢測熒光信號，下圖b展示了相應的結果。
在設計的24組序列中，有16組的開關比（ON/OFF）高于50倍，最高可達350倍。在下圖c中，他們檢測了8組開關比高于50的OFF狀態下熒光強度，并與無GFP的細胞自發熒光和一系列先前報道的基于粘性末端的調控方式下的OFF狀態熒光強度做了對比，可以看到作者他們的方案可以更好的控制住GFP的表達，讓其處于完全關閉的狀態。并且，不同LIRA序列之間的交叉啟動現象非常弱，在所有進行的非同源交叉測試中，僅出現了低于4%的出現了交叉，在LIRA 22和LIRA 18中出現了5.6%的交叉。因此，LIRA至少提供了15種在體內正交調控基因表達的裝置。
鑒于成功構建了15組不受序列限制且互相之間相互影響很弱的LIRA結構，作者進一步構建了多臂的RNA結來實現大腸桿菌體內的分子邏輯門。如下a圖所示，作者成功構建了基于三臂結的有兩種不同RNA輸入的“或”門，b和c圖分別展示了在不同輸入的情況下，其最終開關比和GFP熒光強度的結果。進一步，作者還構建出了d圖中的含有三種不同輸入信號的“或”門，其對應的各種輸入的結果如e和f所示。
此外，基于這種多臂結構的“與”門也被設計出來，如下圖所示。對比前面的設計可以看到，“與”門和 “或”門之間最大的區別在于RBS和AUG的位置。“或”門的RBS和AUG位于主莖上，任意一個分支莖的輸入打開都會引起主莖部分的打開實現翻譯。而“與” 門的RBS和AUG位于最下游的分支莖上，只有從上游分支依次打開才能做到其完全打開推動翻譯的進行。在這里像下圖a和d展示的那樣，作者也構建了分別需要兩種輸入和需要三種輸入的多臂結用來實現對大腸桿菌的控制。其相應的結果分別展示在圖b c和圖e f中，可以很清楚的看到，在這種設計的情況下，只有輸入全部的信號才能實現RNA的翻譯。
基于此，作者已經成功驗證了他們設計的RNA莖環結構響應對特異性底物打開，因此，他們進一步將該系統應用于特定RNA的檢測中。如下圖a和b所示，他們制作了不需要細胞的紙分析系統，該系統含有LacZ ω 蛋白，LaZ的反應底物，當正確輸入信號被檢測到的時候，翻譯出LacZ蛋白，Lac會和LacZ組裝成完整的功能蛋白，催化底物反應。作者成功將這種方式應用于包括Zika,DEN等多種病毒的合成RNA靶標的檢測中。
總結：
作者開發了一種基于多臂 RNA 結操作的策略，該策略可以實現在翻譯水平上的調控。與之前報道的類似系統比起來，該系統不受序列的限制，因此理論上可以被設計成任意合適長度的RNA信號的檢測。而且，在沒有輸入的情況下，該系統的背景信號相比前面基于粘性末端的系統更低，假陽性的可能性更低。通過一些變體的設計，該系統還可以實現“或”門和“與”門的分子邏輯操作調控。此外，該系統還成功結合了LacZ系統實現了不需要細胞的體外紙分析檢測，可以實現多種病毒靶標RNA的快速檢測。
作者最后希望他們的策略可以被進一步應用于構建有價值的內源性RNA報告系統以及控制細胞狀態的分子電路中去，他們也希望基于該策略的診斷方法的特異性和敏感性可以進一步得到提高，其成本也可以得到有效降低，最后未來可以用于應對一些傳染病爆發的檢測中。
參考文獻：
Ma, D., Li, Y., Wu, K. et al. Multi-arm RNA junctions encoding molecular logic unconstrained by input sequence for versatile cell-free diagnostics. Nat. Biomed. Eng 6, 298–309 (2022).
https://doi.org/10.1038/s41551-022-00857-7
