人與自然，似乎從來(lái)就沒有相安無(wú)事過(guò)。
不是因?yàn)閼?zhàn)爭(zhēng)，就是因?yàn)橐咔椤?/span>
不是因?yàn)闅夂蜃兓褪且驗(yàn)榘咨?/span>
塑料回收，刻不容緩
當(dāng)今世界，塑料垃圾已經(jīng)成為和氣候變化相提并論的全球議題，不容忽視。日常生活中，我們隨手丟棄的各種塑料廢棄物，稍有不慎就會(huì)造成土壤和海洋污染，甚至最終進(jìn)入人體。
通過(guò)對(duì)塑料進(jìn)行循環(huán)回收，是有效避免全球白色污染持續(xù)蔓延的有效途徑之一。以最廣泛使用的塑料聚對(duì)苯二甲酸乙酯(PET)為例，高質(zhì)量的透明可回收食品級(jí)PET包裝材料，在近二十年來(lái)的需求量不斷增長(zhǎng)。傳統(tǒng)的收押金的方式進(jìn)行回用，已經(jīng)不能滿足這種高質(zhì)量PET包裝材料的需求。因此，將非食品級(jí)PET廢棄物回收，并用于制造食品級(jí)PET包裝材料，是一個(gè)需要攻克的重大挑戰(zhàn)。
先將PET轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿訂误w，然后提純并重新聚合，從而制造出新的塑料，這是一種“閉環(huán)”回收的形式。然而，化學(xué)降解過(guò)程至少存在以下問題：
1）經(jīng)濟(jì)上不可行：能源密集型，成本不低，也不符合當(dāng)前全球節(jié)能降耗的大局。
2）環(huán)境上不友好：往往需要大量的堿和酸，勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生大量廢水，而且是很難處理的那種。
3）工藝上不成熟：目前化學(xué)方法回收PET的過(guò)程中，非PET材料（如聚乙烯、印刷油墨、標(biāo)簽等）的殘留物會(huì)在沸騰的乙二醇中形成凝膠，阻礙皂化PET的過(guò)濾和進(jìn)一步處理，無(wú)法滿足食品級(jí)高質(zhì)量PET包裝材料的需求。
因此，無(wú)論從經(jīng)濟(jì)的角度、環(huán)境的角度，還是技術(shù)的角度，化學(xué)回收方式都還有很長(zhǎng)的路要走。
那么，
有沒有一條更好的路可以選擇呢？
酶降解技術(shù)，為聚酯類塑料垃圾的回收提供了一條潛在的綠色方案。已有研究表明，來(lái)自酯酶、脂肪酶和角質(zhì)酶的19種不同的PET水解酶(PHEs)，可以用于PET的酶解聚合。
圖. 只有少數(shù)PET廢棄物可以回收制成食品級(jí)可回收聚酯
關(guān)鍵問題
但是現(xiàn)在：
1）還沒有一種酶，可以滿足工業(yè)規(guī)模的塑料降解活性；
2）只有少數(shù)PET廢棄物可以回收制成食品級(jí)可回收包裝材料。
大多數(shù)酶需要在較高的反應(yīng)溫度和面向高度加工的底物時(shí)，才表現(xiàn)出較好的降解性能。最著名的工程PETase變體：thermopetase和DuraPETase雖然在一定條件下耐熱性和催化活性都有所提高，但在溫和的溫度下它們的PET水解活性總體仍然較低。即便是一種極具潛力的PET降解細(xì)菌，也只對(duì)無(wú)定形（非結(jié)晶）PET膜起作用，解聚是不完整的。后來(lái)發(fā)現(xiàn)了更多活性更高的酶，但沒有一種能在可接受的處理時(shí)間內(nèi)完全分解普通PET廢物。
新思路
有鑒于此，美國(guó)德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校的Hal S. Alper等人報(bào)道了一種工程變體PET降解酶：FAST-PETase，為常用的PET基產(chǎn)品閉環(huán)回收提供了一種優(yōu)勢(shì)策略，塑料回收技術(shù)，進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代。研究團(tuán)隊(duì)基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法設(shè)計(jì)了一種穩(wěn)健和活躍的PET水解酶，在30- 50℃和一系列pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的PET水解活性。利用回收的單體重新合成PET，這一閉環(huán)回收過(guò)程為酶降解回收塑料提供了工業(yè)化規(guī)模的可行路線。
技術(shù)方案：
使用機(jī)器學(xué)習(xí)系統(tǒng)預(yù)測(cè)了可能提高酶熱穩(wěn)定性和活性的PET降解酶(PETases)的突變。與野生型和工程型的替代品相比，這種酶具有更好的PET降解活性。
1）機(jī)器學(xué)習(xí)算法設(shè)計(jì)PET水解酶：通過(guò)對(duì)突變體進(jìn)行工程和測(cè)試，確定了一種與野生型PETase相比含有5種突變的酶，命名為FAST-PETase，具有優(yōu)異的催化活性和熱穩(wěn)定性的變異。
2）系統(tǒng)考察了PET水解酶的降解性能：探索了FAST-PETase水解酶在不同溫度，不同pH范圍內(nèi)的性能，并分別對(duì)晶態(tài)PET和非晶態(tài)PET的降解性能進(jìn)行了研究。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
1）快速降解：對(duì)晶態(tài)和非晶態(tài)PET均能高效降解
非晶態(tài)PET可以直接解聚，而晶體PET需要熱預(yù)處理轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)。在室溫下一周內(nèi)或在50°C下一天內(nèi)非晶態(tài)PET可以直接解聚，而晶體含量超過(guò)25%的PET需要經(jīng)過(guò)熱預(yù)處理才能使塑料轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)。
2）普適性：適用于至少51種未經(jīng)處理的PET樣品的降解
具有處理各種塑料廢棄物的能力，對(duì)gf-PET，pc-PET，商用塑料水瓶，商用聚酯產(chǎn)品均表現(xiàn)除了較好的降解效果。
3）實(shí)用性：可用于塑料的閉環(huán)回收，用于食品級(jí)包裝材料。
通過(guò)概念驗(yàn)證，合成了約2.8g無(wú)色PET和3g彩色PET，滿足食品級(jí)包裝材料的品質(zhì)要求。
技術(shù)細(xì)節(jié)
機(jī)器學(xué)習(xí)算法設(shè)計(jì)PET水解酶
假設(shè)高度集中的蛋白質(zhì)工程方法不能考慮整體穩(wěn)定性和活性之間的進(jìn)化權(quán)衡，而一個(gè)中性的、基于結(jié)構(gòu)的深度學(xué)習(xí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通常可以改善酶的功能。為此，作者使用了一個(gè)三維(3D)自我監(jiān)督的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(CNN) MutCompute24來(lái)識(shí)別穩(wěn)定的突變。該算法在訓(xùn)練來(lái)自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)的19,000多個(gè)序列平衡蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上學(xué)習(xí)氨基酸的局部化學(xué)微環(huán)境，并且可以輕松預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中野生型 (WT) 氨基酸不存在的位置。使用MutCompute獲得了WT PETase和ThermoPETase中所有20個(gè)典型氨基酸在每個(gè)位置的結(jié)構(gòu)擬合的離散概率分布，將預(yù)測(cè)的分布呈現(xiàn)在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)上（圖 1a）以識(shí)別WT氨基酸殘基擬合不如潛在取代基的位置，然后根據(jù)預(yù)測(cè)概率對(duì)預(yù)測(cè)進(jìn)行排名（圖 1b），使用逐步組合策略總共生成了159個(gè)單個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)突變。作者還進(jìn)一步表征了具有更好催化活性和熱穩(wěn)定性的變異。在這組突變中，有4個(gè)突變(S121E、T140D、R224Q和N233K)(圖1b)的單獨(dú)和組合的改良程度最高，因此作者選擇這4個(gè)突變進(jìn)行進(jìn)一步組裝和分析。
圖1 機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)的預(yù)測(cè)提高了PETase支架的酶性能
非晶態(tài)PET薄膜的酶降解活性
使用這四種突變?cè)谌齻€(gè)PETase支架(WT PETase, ThermoPETase和DuraPETase)中組裝了所有29種可能的組合。DuraPETaseN233K的Tm為83.5oC，這為迄今為止報(bào)道的最熱穩(wěn)定的PETase突變體，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了MutCompute識(shí)別更高穩(wěn)定性突變體的能力。接下來(lái)使用非晶態(tài)PET薄膜評(píng)估變體在30-60oC溫度范圍內(nèi)的PET水解活性。對(duì)比表明機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)的預(yù)測(cè)大大增強(qiáng)了所有支架的活動(dòng)并擴(kuò)展了工作溫度范圍（圖 1c）。在相同的溫度下，PETaseS121E/R224Q/N233K在30和40℃分別比WT PETase（圖 1c）的PET水解活性提高了3.4倍和29倍。在這一組中最好的變體被命名為FAST-PETase，在40℃和50℃與單獨(dú)的ThermoPETase相比其活性分別高出2.4倍和38倍（圖 1c）。在50°C時(shí)FAST-PETase 顯示出所有突變體的最高整體降解，測(cè)試96小時(shí)釋放了33.8 mM的PET單體（圖 1c）。在這些條件下FAST-PETase成為溫和溫度和中等pH條件下原位PET降解的優(yōu)秀候選。
圖2 WT和賴氨酸突變酶的耐熱性和PET水解活性
pc-PET的酶降解活性
接下來(lái)研究使用替代PHEs的基于機(jī)器學(xué)習(xí)的預(yù)測(cè)的可移植性和通用性。選擇了N233K突變并將這種相應(yīng)的賴氨酸突變引入LCC、ICCM和類角質(zhì)酶Cut190。產(chǎn)生的Cut190和LCC的賴氨酸突變變體相對(duì)于它們各自的支架（圖 2a）都顯示出顯著增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性（ΔTm=7 oC），而ICCM的賴氨酸突變變體顯示出96.3 oC的Tm。更重要的是這三種賴氨酸突變變體在非晶態(tài)gf-PET上的水解活性明顯高于它們各自的支架（圖2b），從而展示了突變的可移植性。除了模型塑料基質(zhì)，在未經(jīng)處理的pc-PET上展示PETase酶的性能也是至關(guān)重要的。為此收集了51份用于食品、飲料、藥品、辦公用品、家庭用品和化妝品包裝的塑料產(chǎn)品樣本并在50 ℃下用FAST-PETase對(duì)這些原料進(jìn)行了酶處理。盡管它們?cè)诟鞣矫娲嬖诋愘|(zhì)性，但來(lái)自這一系列PET樣品都能在1周甚至24小時(shí)內(nèi)被FAST-PETase完全降解（圖3a）。FAST-PETase的解聚幾乎以線性速率發(fā)生，同時(shí)伴隨薄膜的線性質(zhì)量損失。
圖3 FAST-PETase在熱成型pc-PET產(chǎn)品的酶解反應(yīng)中的優(yōu)越性能
對(duì)豆餅容器的時(shí)間過(guò)程分析（圖3b）顯示，在16小時(shí)內(nèi)結(jié)晶度從1.2增加到7.7%，幾乎呈線性衰減。原子力顯微鏡(AFM) （圖3c）和掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)一步描述了FAST-PETase的反應(yīng)過(guò)程，在反應(yīng)過(guò)程中它在pc-PET表面產(chǎn)生越來(lái)越深、越來(lái)越大的孔導(dǎo)致表面粗糙度和可見的不透明度增加。相比在相同條件下，WT PETase、ThermoPETase、DuraPETase、LCC和ICCM對(duì)該pc-PET的PET水解活性大大低于FAST-PETase（圖3b）。LCC和ICCM的活性即使在最佳反應(yīng)溫度下仍然比FAST-PETase在50°C的活性分別低4.9倍和1.5倍。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析表明LCC和ICCM在60°C時(shí)對(duì)該pc-PET膜表現(xiàn)出最高的降解率，但其活性仍低于50°C時(shí)FAST-PETase的活性。通過(guò)增加凈反應(yīng)體積這種FAST-PETase支持的解聚很容易擴(kuò)展到未經(jīng)處理的大塊塑料上。
商用PET水瓶和聚酯產(chǎn)品的酶降解活性
接下來(lái)試圖研究商用PET水瓶是否可以被FAST-PETase酶水解。水瓶是通過(guò)吹塑生產(chǎn)的，這使得大多數(shù)瓶子在膨脹過(guò)程中高度結(jié)晶（>25%結(jié)晶度）。高結(jié)晶的聚合物不易受到酶的攻擊。為了更全面地評(píng)價(jià)酶解聚合測(cè)定了瓶子各個(gè)部分的結(jié)晶度，發(fā)現(xiàn)頸和中心相對(duì)來(lái)說(shuō)是無(wú)定形的（1.2和11.7%結(jié)晶度），而瓶子的其他部分是高度結(jié)晶度的（25.9到33.8%結(jié)晶度）（圖4a）。為了評(píng)估未經(jīng)處理的水瓶原始切片的生物降解性，從這些區(qū)域中切下或穿孔片段并在50°C下用FAST-PETase處理24小時(shí)。結(jié)果（圖4b）顯示在頸部和基底中心區(qū)域?qū)崿F(xiàn)了大量單體的釋放，而瓶的其余部分只釋放了微量單體(0.09 -0.14 mM)，這表明高結(jié)晶度對(duì)酶解聚速率有負(fù)面影響。進(jìn)一步比較了FAST-PETase與嗜熱酶LCC和ICCM在50-72°C范圍內(nèi)的水解活性。結(jié)果表明任何測(cè)試的酶和溫度都不能有效地解聚高結(jié)晶體部分。為了解決水瓶完全降解的挑戰(zhàn)，作者使用了簡(jiǎn)單的熱預(yù)處理，通過(guò)融化整個(gè)瓶子然后快速的溫度淬火使PET變得均勻無(wú)定形。通過(guò)使用該預(yù)處理瓶上的穿孔膜比較了FAST-PETase和其他PHEs在50-72°C溫度下的水解活性（圖4）。結(jié)果表明，FAST-PETase對(duì)預(yù)處理過(guò)的瓶膜具有良好的解聚效果，在50℃下24 h內(nèi)可釋放出32.8 mM的PET單體，是所有PHEs和溫度組合中解聚效果最好的。最后作者證明了一個(gè)完整的、非物理破壞的融化的塑料冰球可以在50°C下在不到2周的時(shí)間內(nèi)被FAST-PETase基本上完全降解（圖4d）。除了包裝材料PET在合成紡織工業(yè)中被大量使用。為此評(píng)估了FAST-PETase在降解部分商用聚酯產(chǎn)品中的應(yīng)用潛力。5種不同的商用聚酯產(chǎn)品在50°C下用FAST-PETase處理，相對(duì)于用其他PHEs處理的樣品，釋放出更多的PET單體（圖4e）。這表明FAST-PETase可用于快速、有效地降解紡織織物中的PET片段，為從商用聚酯產(chǎn)品中回收PET單體和減少微纖維在環(huán)境中的浸出提供了一條潛在的途徑。
圖4 FAST-PETase解聚PET水瓶和聚酯產(chǎn)品及在PET酶化學(xué)回收中的應(yīng)用
展望
作者基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法設(shè)計(jì)了一種穩(wěn)健和活躍的PET水解酶FAST-PETase，可在相對(duì)“溫和”的條件下完全、超快速解聚PET。在室溫下一周內(nèi)或在50°C下一天內(nèi)非晶態(tài)PET可以直接解聚，而晶體含量超過(guò)25%的PET需要經(jīng)過(guò)熱預(yù)處理才能使塑料轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)。51種未經(jīng)處理的PET產(chǎn)品樣品也被證明可以用這種酶降解，表明它有處理各種原材料的能力。作者進(jìn)一步展示了FAST-PETase可用于塑料的閉環(huán)回收，可生產(chǎn)約2.8g無(wú)色PET和3g彩色PET。這項(xiàng)研究為塑料回收，提供了全新的借鑒。
那么，問題來(lái)了：這種酶，有望大規(guī)模生產(chǎn)嗎？
參考文獻(xiàn)：
【1】Hal S. Alper et. al. Machine learning-aided engineering ofhydrolases for PET depolymerization.Nature, 2022, 604:662-667
DOI: 10.1038/s41586-022-04599-z.
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04599-z
【2】Eggo U. Thoden van Velzen & GiusySantomasi. Tailor-made enzymes
for plastic recycling.Nature, 2022
https://www.nature.com/articles/d41586-022-01075-6
