膜納米孔的內(nèi)腔決定了它們?cè)谏飳W(xué)和技術(shù)中的功能。在納米孔傳感中，通道寬度控制單個(gè)分子的進(jìn)入和通過(guò)，并影響分析物阻塞通道管腔時(shí)產(chǎn)生的電讀出信號(hào)。因此，大約1到5 nm 寬度的生物蛋白質(zhì)孔能夠感應(yīng)同等大小的 DNA 鏈、有機(jī)分子和小蛋白質(zhì)。超越目前的尺度范圍在科學(xué)上是令人興奮的，并且在研究和傳感方面具有相關(guān)性。例如，更寬的納米孔可以在單分子水平上改變對(duì)大型酶、免疫球蛋白、蛋白質(zhì)復(fù)合物甚至病毒的快速和直接感應(yīng)和檢測(cè)。超出生物范圍還可能導(dǎo)致非圓柱形納米孔更好地匹配不規(guī)則形狀的分析物。作為一個(gè)額外的理想特性，寬且形狀明確的納米孔應(yīng)攜帶分子受體，以實(shí)現(xiàn)高度特異性的分析物識(shí)別或分析物分子的束縛，以進(jìn)行詳細(xì)的生物物理檢查。最后，下一代納米孔應(yīng)該與廣泛的電子讀數(shù)兼容，包括便攜式 DNA 測(cè)序開創(chuàng)性的手持式 MinION 試劑盒，但迄今為止尚未用于蛋白質(zhì)檢測(cè)。理想的納米孔還提供了傳感以外的應(yīng)用，例如形成合成細(xì)胞和刺穿生物細(xì)胞以運(yùn)送生物活性物質(zhì)。到目前為止，盡管取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但下一代納米孔還無(wú)法通過(guò)工程蛋白質(zhì)或肽組裝來(lái)實(shí)現(xiàn)。一個(gè)基本的挑戰(zhàn)是氨基酸的小尺寸和多肽的復(fù)雜折疊成大的獨(dú)特蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。鑒于核苷酸的更大尺寸、簡(jiǎn)單的堿基配對(duì)規(guī)則和易于預(yù)測(cè) DNA 折疊，DNA是設(shè)計(jì)更大納米級(jí)結(jié)構(gòu)的替代材料。事實(shí)上，DNA 膜納米孔以前已制成通道直徑高達(dá) 10 納米。所有現(xiàn)有的DNA納米孔都使用DNA雙鏈的經(jīng)典平行排列，以垂直方式刺穿膜。鑒于此，倫敦大學(xué)學(xué)院Stefan Howorka等人報(bào)道了DNA的合理設(shè)計(jì)可以極大地?cái)U(kuò)展膜納米孔的結(jié)構(gòu)和功能范圍。該課題組探討了DNA分子設(shè)計(jì)如何將膜納米孔的大小和形狀擴(kuò)展到當(dāng)前生物和工程領(lǐng)域之外。成果發(fā)表在Nature Nanotechnology上。
在開始設(shè)計(jì)DNA納米孔時(shí)，研究人員注意到，材料的自由性受到了過(guò)度的限制，因?yàn)樗须p鏈體都以垂直于膜的方式定向。因此，研究人員決定利用DNA構(gòu)建所提供的構(gòu)建自由來(lái)克服這個(gè)限制。在這個(gè)孔中，成束的DNA雙鏈體形成亞基，這些亞基以模塊化方式平行于膜排列，形成確定的形狀。模塊化子單元的使用可以提供前所未有的孔形狀和尺寸設(shè)計(jì)范圍，如一系列孔多邊形（包括三角形、正方形、五邊形和六邊形）所示。結(jié)合可控子單元的邊長(zhǎng)（10 和 20nm），設(shè)計(jì)的通道管腔可以從 10nm 子單元長(zhǎng)度的三角形的 43nm2變換為 20nm 子單元長(zhǎng)度的正方形的 400nm2。與廣泛使用的蛋白質(zhì)孔（α-溶血素）的 1.5nm2管腔面積相比，較大尺寸的 DNA 納米孔要大出260倍。
圖|形狀和大小可調(diào)的基于 DNA 的膜納米孔該孔結(jié)構(gòu)具有一個(gè)額外的膜帽（確定整體孔隙形狀）和一個(gè)筒（穿透膜）。通過(guò)確定子單元的雙鏈體數(shù)，帽的高度和寬度是可調(diào)的。帽結(jié)構(gòu)的亞基通過(guò)亞基最內(nèi)層雙鏈體位置的短單鏈 DNA 鏈接連接。此外，剛性的子單元間雙鏈體可以防止帽翻轉(zhuǎn)，并防止偏離設(shè)計(jì)形狀。帽的幾何形狀也決定了孔的跨膜筒。在膽固醇-脂質(zhì)錨定物的幫助下，跨膜筒可以刺穿膜。這種孔設(shè)計(jì)應(yīng)該允許孔插入經(jīng)典的脂質(zhì)雙層，也可以插入MinION的流動(dòng)細(xì)胞膜，用于直接和便攜式檢測(cè)免疫相關(guān)蛋白質(zhì)。圖|帽和 DNA 納米孔的組裝和結(jié)構(gòu)表征通過(guò)單通道電流記錄實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了DNA納米孔通過(guò)一個(gè)明確但可調(diào)的通道腔刺穿雙層膜。此外，實(shí)驗(yàn)還驗(yàn)證了DNA納米孔可以在單分子水平上對(duì) IgG 抗體進(jìn)行無(wú)標(biāo)記、直接和特異性檢測(cè)。并且，研究人員最終還評(píng)估了 DNA 納米孔可以插入高通量 MinION 流動(dòng)細(xì)胞的膜中以快速檢測(cè)人類 SARS-CoV-2 抗體。圖|分別使用雙層和便攜式 MinION 記錄進(jìn)行特異性和無(wú)標(biāo)記 IgG 傳感。綜上，考慮到膜納米孔在自然界和技術(shù)中的重要性，該研究引入了合成版本，這些版本在生物學(xué)不提供的尺寸和形狀條件下運(yùn)行。通過(guò)利用 DNA 納米技術(shù)獲得了廣闊的設(shè)計(jì)空間，并且通過(guò)使用廣泛使用的臺(tái)式和手持分析設(shè)備直接檢測(cè)通道腔內(nèi)的單個(gè)蛋白質(zhì)分子來(lái)證明該方法的實(shí)用性。未來(lái)可能會(huì)改進(jìn)大的 DNA 納米孔，以產(chǎn)生不規(guī)則的多邊形孔幾何形狀，以匹配不對(duì)稱形狀的分析物。不規(guī)則的幾何形狀可以通過(guò)長(zhǎng)度不均勻的孔亞基和可變的亞基間角度來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)在任何管腔位置放置任何類型和數(shù)量的識(shí)別標(biāo)簽，可以進(jìn)一步增強(qiáng) DNA 納米孔的單分子分析，這是任何其他由蛋白質(zhì)、固態(tài)或混合材料組成的孔所無(wú)法做到的。單分子分析之外的一種應(yīng)用是使用 DNA 納米孔在細(xì)胞間運(yùn)輸生物活性貨物。在膜之外，一個(gè)同樣令人興奮的前景是使用高度可調(diào)的 DNA 支架來(lái)包裹酶并設(shè)計(jì)具有增強(qiáng)催化活性的多酶組裝體。總之，該合成孔路線為實(shí)際應(yīng)用提供了功能性 DNA 納米結(jié)構(gòu)，利用自然界無(wú)法獲得的生物分子結(jié)構(gòu)推進(jìn)了合成生物學(xué)，并有助于改變便攜式和快速的蛋白質(zhì)傳感，從而對(duì)社會(huì)產(chǎn)生影響。Xing,Y., Dorey, A., Jayasinghe, L. et al. Highly shape- and size-tunable membranenanopores made with DNA. Nat. Nanotechnol. (2022).https://doi.org/10.1038/s41565-022-01116-1
