2014年，哈佛大學(xué)的Peng Yin和William Shin課題組一起報道了一種叫做DNA-PAINT新的超分辨技術(shù)（DOI：10.1038/nmeth.2835）。PAINT（Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography，用于納米形貌成像的點聚集）技術(shù)是一個使用快速和瞬態(tài)染料一次捕獲多個熒光點的過程。其依賴于熒光分子與配體的隨機動態(tài)結(jié)合，而不是永久結(jié)合的熒光團的隨機光激活。DNA分子的雜交是一個動態(tài)平衡的過程，因此帶有熒光基團的DNA被用來實現(xiàn)PAINT的過程，雜交集合到靶標DNA上的熒光探針與游離的熒光探針之間的熒光信號有很大的差異，進而實現(xiàn)了對靶標結(jié)構(gòu)的超分辨成像。然而，常規(guī)的DNA-PAINT仍然存在很多限制（圖1a 左上 ）。首當其沖的一點，由于這個方法本身的局限性，DNA-PAINT會存在較強的背景信號，為了盡可能降低這個問題的影響，常規(guī)的DNA-PAINT往往會借助TIRF（全內(nèi)反射）結(jié)構(gòu)光來增加信噪比，這樣的做法會讓成像的范圍局限在玻片的表面，難以實現(xiàn)三維層面的成像。后續(xù)人們?yōu)榱私档捅尘靶盘栆矊@個技術(shù)做出了一些改進，例如基于FRET的DNA-PAINT（圖1a 右上）和通過設(shè)計含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標來降低未結(jié)合探針信號（圖1a 左下）的策略。然而，基于FRET的DNA-PAINT被證實其定位的精度還要低于常規(guī)的DNA-PAINT，而基于莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針的DNA-PAINT會降低探針和靶標結(jié)合的速率從而導(dǎo)致成像速率的受到很大的影響。基于以上的背景，來自耶魯大學(xué)藥學(xué)院的Joerg Bewersdorf教授和他的合作者們一起提出了一種簡單有效的Fluorogenic DNA-PAINT策略來改進現(xiàn)有的DNA-PAINT技術(shù)以實現(xiàn)更快更高分辨成像的目的。
他們的方案如圖1a 右下所示。他們的設(shè)計原理與此前的莖環(huán)結(jié)構(gòu)分子信標類似，通過在DNA鏈的兩端分別修飾熒光基團（Cy3B）和淬滅基團（BHQ2），對沒有結(jié)合到靶標上的探針而言，淬滅基團會很大程度上降低其熒光信號從而提升信噪比。與此前的莖環(huán)結(jié)構(gòu)不同，他們的探針并沒有去設(shè)計這種二級結(jié)構(gòu)，但由于單鏈DNA本身是柔性分子，因此自由狀態(tài)下探針的熒光信號會得到很大程度上降低，如圖1b所展示的，在未結(jié)合狀態(tài)下探針的信號不足結(jié)合狀態(tài)下探針信號的2.5%。也正因為沒有二級結(jié)構(gòu)的存在，探針和靶標的結(jié)合速率相比此前具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針而言會快很多從而在一定程度上提升了成像速率。為了保證結(jié)合上去的探針可以正常發(fā)光，就必須保證結(jié)合狀態(tài)下淬滅基團和熒光基團之間具有足夠的間距。這就對互補靶標和探針分子互補配對區(qū)域的長度有了一定的要求，理論上至少需要15個堿基對的長度。但是想實現(xiàn)高速成像需要靶標和探針配對區(qū)域短于10個堿基對的。為了同時實現(xiàn)高速結(jié)合以及高效發(fā)光，他們在配對區(qū)域之中引入了一些錯配，在保證間距的同時也進一步提高了結(jié)合速率。如圖2所示，他們分別用他們的方案和常規(guī)DNA-PAINT對固定的微管進行成像，原本需要8小時的成像用Fluorogenic DNA-PAINT僅僅20分鐘就可以實現(xiàn)。圖2 常規(guī)DNA-PAINT與Fluorogenic DNA-PAINT的對比為了測試他們的系統(tǒng)，如圖3他們首先構(gòu)建了一個具有48個結(jié)合位點的環(huán)狀DNA折紙結(jié)構(gòu)并用他們設(shè)計的方案對其進行TIRF成像，他們分別在1分鐘，3分鐘，7分鐘的時候采集了圖像，并對結(jié)果進行平均之后得到環(huán)狀結(jié)構(gòu)的測量直徑是60.5±2.0 nm。這與他們設(shè)計的理論值62nm是相吻合的。圖3 Fluorogenic DNA-PAINT對環(huán)形DNA折紙結(jié)構(gòu)的高速成像此外，他們想知道他們設(shè)計的新系統(tǒng)是否可以擺脫傳統(tǒng)DNA-PAINT必須依賴TIRF結(jié)構(gòu)光的問題，從而實現(xiàn)一定程度上的3維成像。在明場下找到想檢測的區(qū)域后，他們可以僅使用10 nM濃度的探針在10分鐘內(nèi)完成高質(zhì)量3維微觀網(wǎng)絡(luò)的超分辨成像。圖4 不依賴特殊結(jié)構(gòu)光的迅速3維Fluorogenic DNA-PAINT成像為了進一步拓展這個方法用于多色成像，他們設(shè)計了另外一組與之前所用探針-靶標相正交的新的探針，并使用ATTO 643和Iowa Black FQ標記新的探針。最終，他們實現(xiàn)了10分鐘之內(nèi)在U-2 OS細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的雙色成像，并且沒有借助特殊的光學(xué)結(jié)構(gòu)。總的來說，作者在已經(jīng)現(xiàn)有的DNA-PAINT技術(shù)的基礎(chǔ)上通過一些簡單的改動，實現(xiàn)了降低背景信號同時又可以高速成像的目標，并且，該方法可以一定程度上幫助DNA-PAINT擺脫結(jié)構(gòu)光的限制，還可以實現(xiàn)多種靶標的同時成像。也正因為用到的成像鏈對和靶標是部分互補配對的，因此任何一個靶標都可能可以有多種潛在的成像鏈。雖然有諸多優(yōu)點，但是這個方案也存在其固有的缺點。因為靶標和成像鏈并不完全配對，對一些特定的序列很接近靶標，這個方法或許沒有很好的識別能力。但是瑕不掩瑜，總的來說，這個方案還是對DNA-PAINT技術(shù)一個很大的補充。Chung, K.K.H., Zhang, Z., Kidd, P. et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods (2022). https://doi.org/10.1038/s41592-022-01464-9
