2016年7月，來自日本的大隅良典因?yàn)槠鋵?duì)自噬機(jī)制的探究而被授予諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)，這是繼Christian De Duve發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象后第二個(gè)在自噬領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)開拓性進(jìn)展的學(xué)者。自噬是指將一部分細(xì)胞質(zhì)封存以形成雙膜自噬體，隨后將這些自噬體運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，其中其內(nèi)容物被降解。自噬水平降低與神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和癌癥有關(guān)。然而，自噬也是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的主要機(jī)制之一。
自噬的保護(hù)作用和有害作用總是處于一種微妙的平衡之中。目前常用的LC3熒光檢測(cè)可用于測(cè)量細(xì)胞中和暴露組織表面的自噬通量。然而，這種方法需要對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，并且不支持體內(nèi)自噬的檢測(cè)，特別是在心臟等深層組織中。因此，迫切需要一種新技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬過程的體內(nèi)成像和測(cè)量。
近日,在Howard H Chen的領(lǐng)導(dǎo)下，哈佛醫(yī)學(xué)院A.A. Martinos生物醫(yī)學(xué)成像中心和塔夫茨大學(xué)分子心臟病學(xué)研究所的研究員們開發(fā)了一種自噬檢測(cè)納米顆粒（ADN），能夠?qū)ψ允蛇M(jìn)行成像并在體內(nèi)非侵入性地測(cè)量其通量。這些納米顆粒修飾有組織蛋白酶可切割的富含精氨酸的肽，這些肽具有近紅外熒光色素Cy5.5的功能，同時(shí)可以促進(jìn)早期自噬體對(duì)納米顆粒的攝取。自噬體的通量可以通過靜脈注射的氧化鐵納米顆粒的磁共振或近紅外熒光成像來測(cè)量。
設(shè)計(jì)理念：
ADN的核心由超順磁性氧化鐵納米顆粒（FH）構(gòu)成，其表面修飾有富含精氨酸的肽，這增強(qiáng)了自噬體對(duì)探針的攝取。平均每個(gè)NP可以提供五個(gè)肽鏈尾端，以供近紅外熒光色素（Cy5.5）結(jié)合，提供可激活的熒光標(biāo)記。自噬期間的溶酶體中組織蛋白酶活性上調(diào)，進(jìn)而裂解ADN表面的裂解富含精氨酸的肽，將近紅外熒光色素釋放。吸收分光光度法顯示，ADN上的Cy5.5熒光色素在625?nm處有一個(gè)顯著的峰值，而用胰蛋白酶激活探針后，吸收峰恢復(fù)為675nm。675/625nm峰與熒光信號(hào)強(qiáng)度的比率的強(qiáng)度變化時(shí)間分布也是相似的。組織蛋白酶/蛋白酶對(duì)肽的切割導(dǎo)致Cy5.5從FH-肽結(jié)構(gòu)中分離并產(chǎn)生強(qiáng)大的熒光。
圖 ADN的表征及其體外驗(yàn)證
NPs對(duì)自噬的特異性：
為了進(jìn)一步證明ADN對(duì)自噬的特異性，設(shè)計(jì)合成了探針的D-異構(gòu)體（FH-D-ISO），使得肽鏈無法切割。與ADN不同，F(xiàn)H-D-ISO暴露于蛋白酶/胰蛋白酶不會(huì)改變其吸光度光譜或?qū)е聼晒獍l(fā)射。在H9C2細(xì)胞中，也只有ADN探針可以正確表達(dá)信號(hào)。
對(duì)于自噬蛋白ATG5和ATG7遺傳缺陷，ADN并未表現(xiàn)出應(yīng)有的信號(hào)變化。在siRNA敲低ATG7的H9C2細(xì)胞中也觀察到ADN激活障礙。為了更好地表征溶酶體活化前ADN的動(dòng)力學(xué)，使用抗體（DX-1）聯(lián)合葡聚糖在NP表面形成涂層。在暴露后15分鐘內(nèi)，在饑餓的H9C2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到大量的ADN，即使在預(yù)冷至4°C以消除內(nèi)吞也是如此。1小時(shí)后，ADN濃縮到早期自噬體中，并與細(xì)胞質(zhì)中>80%的LC3-GFP點(diǎn)狀物共定位。總的來說，ADN可以通過直接易位進(jìn)入細(xì)胞，并被早期自噬體內(nèi)化，輸送到溶酶體并被溶酶體組織蛋白酶原位激活。
圖 ADN激活的特異性及其在早期自噬體中的攝取
NPs在自噬小鼠模型中的驗(yàn)證：
使用三種模型系統(tǒng)測(cè)試了ADN在離體鼠心肌細(xì)胞自噬成像的能力。對(duì)于IR損傷模型，在再灌注4小時(shí)后，在缺血區(qū)觀察到僅觀察到ADN熒光。在24小時(shí)饑餓模型中，在整個(gè)心肌中觀察到ADN激活，饑餓小鼠的熒光強(qiáng)度比對(duì)照小鼠高1.4±0.1倍。而具有對(duì)照探針的饑餓小鼠中未觀察到熒光增加。饑餓期間的ADN熒光在心臟，小腸和脾臟中增加最多，這表明在饑餓期間這些組織中自噬特別上調(diào)。
作者團(tuán)隊(duì)先前報(bào)道了一種心肌細(xì)胞特異性過度表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物4樣（DDiT4L）和自噬的轉(zhuǎn)基因小鼠的開發(fā)。在DDiT4L轉(zhuǎn)基因小鼠中，心臟的三維多平面表示出強(qiáng)大的ADN熒光，但在對(duì)照小鼠中沒有。這一結(jié)果，結(jié)合在IR、饑餓和H9C2細(xì)胞中獲得的結(jié)果，表明ADN是一種敏感和特異的自噬通量標(biāo)記物。
圖 使用ADN進(jìn)行心肌細(xì)胞自噬體外成像
NPs檢測(cè)Dox對(duì)心肌細(xì)胞自噬通量影響：
對(duì)于DOX的心臟毒性與自噬的關(guān)系，目前學(xué)界仍有爭(zhēng)議。使用ADN進(jìn)一步探究這個(gè)問題，將H9C2細(xì)胞暴露于Dox下24小時(shí)，并通過蛋白質(zhì)印跡和熒光活化細(xì)胞分選（FACS）測(cè)量自噬通量。與載體對(duì)照相比，Dox暴露使自噬蛋白LC3 I降低，對(duì)LC3 II無影響，p62水平顯著升高。將H9C2細(xì)胞暴露于Dox可顯著減少ADN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，并顯著增加膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性細(xì)胞群。這些數(shù)據(jù)與Dox導(dǎo)致自噬通量延遲阻滯和凋亡細(xì)胞死亡增加的結(jié)果一致。
圖 NPs檢測(cè)Dox以及預(yù)饑餓對(duì)心肌細(xì)胞自噬通量影響
Dox給藥的小鼠自噬成像：
在兩種給藥條件下在小鼠中測(cè)試Dox對(duì)體內(nèi)心肌細(xì)胞自噬的影響。在用單劑量Dox小鼠中，Dox顯著增加了ANX熒光并降低了ADN熒光。在給予Dox之前，饑餓24小時(shí)以激活自噬，進(jìn)而將ADN信號(hào)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，與注射PBS的對(duì)照小鼠相當(dāng)。饑餓前自噬的激活與心肌細(xì)胞凋亡的減少有關(guān)。饑餓的正性結(jié)果不是由于心肌中Dox的攝取或保留減少，因?yàn)镈ox熒光在兩組中無顯著差異。而Dox熒光的程度與來自ADN的信號(hào)成反比。
慢性低劑量方案持續(xù) 5 周在每次Dox注射前預(yù)先饑餓的小鼠中，在最后一次Dox給藥后8周的超聲心動(dòng)圖顯示心輸出量，每搏體積和應(yīng)變率顯著改善。此外，在隨訪的8周內(nèi)，在預(yù)饑餓的小鼠中觀察到死亡率顯著降低。
圖 小鼠Dox前預(yù)饑餓處理的影響
小鼠體內(nèi)心肌細(xì)胞自噬成像和通量檢測(cè)：
接下來使用ADN對(duì)饑餓模型體內(nèi)心臟中的自噬進(jìn)行成像。在4-6小時(shí)進(jìn)行與X射線計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）共同記錄的三維熒光成像，并確認(rèn)饑餓小鼠中胸部信號(hào)升高來自心臟。通過進(jìn)一步的動(dòng)力學(xué)建模表明，饑餓將自噬通量增加到每小時(shí)每細(xì)胞40個(gè)自噬小體以上，并導(dǎo)致每個(gè)心肌細(xì)胞中累積超過130個(gè)自噬小體。
接下來，在更長(zhǎng)時(shí)間（48小時(shí)）內(nèi)測(cè)量體內(nèi)自噬的動(dòng)態(tài)變化。通過饑餓和再喂養(yǎng)來調(diào)節(jié)心臟自噬的效果快速而強(qiáng)大。相比之下，饑餓的小鼠給予雷帕霉素幾乎沒有任何影響。使用磁共振成像（MRI）檢測(cè)信號(hào)，饑餓小鼠心肌中的R2顯著升高。心臟切片的蛋白質(zhì)印跡和共聚焦顯微鏡檢查顯示，在饑餓的小鼠中，表明自噬的LC3II / I的比例增加。總的來說，體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，ADN可以通過磁共振或熒光檢測(cè)到，自噬通量檢測(cè)是一個(gè)快速有效的過程，饑餓對(duì)自噬的刺激可以部分減輕心臟毒性藥物的毒性。
圖 使用ADN進(jìn)行自噬體內(nèi)成像。
小結(jié)：
ADN可以通過直接易位穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，或通過內(nèi)吞作用和隨后的內(nèi)體轉(zhuǎn)移。這兩個(gè)過程都是通過用細(xì)胞穿透肽（如聚精氨酸）修飾NPs來促進(jìn)的。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，ADN被LC3-GFP陽(yáng)性早期自噬體迅速吸收。因此，ADN上的聚精氨酸肽具有多種功能，包括細(xì)胞穿透，內(nèi)體轉(zhuǎn)移，刺激自噬體攝取和溶酶體組織蛋白酶的切割，從而激活熒光。
測(cè)量自噬體通量的重要性正日益得到認(rèn)識(shí)。自噬體或溶酶體對(duì)ADN的攝取導(dǎo)致NPs的局灶性聚集，其磁弛度顯著增加，便于MRI檢測(cè)。ADN的熒光信號(hào)提供了更準(zhǔn)確的通量檢測(cè)，因?yàn)?/span>只有那些被輸送到溶酶體的含有ADN的自噬體才會(huì)經(jīng)歷組織蛋白酶介導(dǎo)的表面肽的裂解并發(fā)出熒光。體內(nèi)成像證明，心肌細(xì)胞每小時(shí)能夠攜帶>40個(gè)自噬體，并在20分鐘內(nèi)消化潛在有害的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物。這可能可以有效地中和大多數(shù)促凋亡刺激，同時(shí)避免細(xì)胞過度消耗能量。
迄今為止，自噬在體內(nèi)尚無辦法可以實(shí)現(xiàn)測(cè)量。作者團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種設(shè)計(jì)合理的ADN，可以通過熒光或磁共振成像進(jìn)行檢測(cè)。他們用ADN表明，心肌細(xì)胞能夠?qū)⒆允审w迅速輸送到溶酶體，但這一過程被幾種常見的心臟毒性藥物所抑制。而在化療期間誘導(dǎo)短暫自噬爆發(fā)也可以具有高度的心臟保護(hù)作用。ADN提供自噬通量的準(zhǔn)確檢測(cè)，有助于更好地了解自噬在各種疾病狀態(tài)中的作用。
參考文獻(xiàn)：
Howard H Chen, Zehedina Khatun, Lan Wei, et al. A nanoparticle probe for the imaging of autophagic flux in live mice via magnetic resonance and near-infrared fluorescence. Nat Biomed Eng. 2022 Jul 11.
https://www.nature.com/articles/s41551-022-00904-3
