熒光蛋白的低光穩(wěn)定性是熒光顯微鏡許多應(yīng)用中的限制因素，如何改進(jìn)該特性是目前成像界（特別是生物成像領(lǐng)域）想要解決的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。由于基因轉(zhuǎn)移和蛋白質(zhì)靶向技術(shù)的改進(jìn)，現(xiàn)在可以使用熒光蛋白標(biāo)記并有效觀察細(xì)胞器和細(xì)胞骨架等亞細(xì)胞成分。此外最近對(duì)亞細(xì)胞成分進(jìn)行的時(shí)間分辨率良好的觀察揭示了它們精細(xì)結(jié)構(gòu)的快速運(yùn)動(dòng)。然而，與化學(xué)染料相比，熒光蛋白因其快速的光漂白而臭名昭著，這意味著研究人員必須使用明亮標(biāo)記的細(xì)胞，盡量減少照明功率，并使用延時(shí)成像。然而，有人擔(dān)心，由于過(guò)度表達(dá)，明亮標(biāo)記的細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生人為信號(hào)，低照明功率可能會(huì)導(dǎo)致光子預(yù)算不佳，從而阻礙大多數(shù)超分辨率成像技術(shù)的使用，而時(shí)間下采樣（延時(shí)）可能會(huì)錯(cuò)過(guò)瞬時(shí)但重要的信號(hào)。因此，需要高光穩(wěn)定性的熒光蛋白來(lái)改善這些不良情況。 近日，日本理化學(xué)研究所先進(jìn)光子學(xué)研究中心Atsushi Miyawaki和日本北里大學(xué)Kazuhiko Katayama等人使用水母 Cytaeis uchidae 來(lái)解決熒光蛋白光穩(wěn)定性差的問(wèn)題。他們發(fā)現(xiàn)其主要熒光蛋白的光穩(wěn)定性比目前使用的任何熒光蛋白高10倍以上。通過(guò)設(shè)計(jì)一個(gè)不僅提高了光穩(wěn)定性而且亮度與其他熒光蛋白相當(dāng)?shù)陌姹荆麄儎?chuàng)建了StayGold，為成像界提供了一個(gè)強(qiáng)大的新工具。這種增強(qiáng)的光穩(wěn)定性很有趣，因?yàn)殚_(kāi)發(fā)熒光蛋白似乎涉及亮度和光穩(wěn)定性之間的權(quán)衡。在使用熒光蛋白時(shí)，分子氧 (O2) 通常是一把雙刃劍。一方面，熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的成熟需要氧化反應(yīng)，而對(duì)O2 的高可及性有助于提高實(shí)際亮度。另一方面，熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的分解是由O2 引起的，而熒光蛋白發(fā)色團(tuán)處于單重或三重激發(fā)態(tài)，因此增強(qiáng)的O2可及性會(huì)降低光穩(wěn)定性。使用StayGold，研究人員優(yōu)先選擇了適度的明亮細(xì)胞，可以在長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞范圍內(nèi)、快速、連續(xù)的超分辨率成像。該課題組主要采用了三維結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡（3D-SIM），該顯微鏡使用三束照明創(chuàng)建了3D干涉圖案。圖|水母衍生熒光蛋白 StayGold 的光穩(wěn)定性在多個(gè)細(xì)胞中對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了6分鐘的成像，而不降低超分辨率圖像質(zhì)量。6分鐘的觀察期足夠長(zhǎng)，可以連續(xù)施用兩種藥物，一種啟動(dòng)鈣動(dòng)員，另一種關(guān)閉鈣動(dòng)員。研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子動(dòng)員后，ER網(wǎng)絡(luò)的整體重排被減弱。但是，一旦固定樣品，光細(xì)胞毒性就不再是一個(gè)問(wèn)題，通過(guò)使用強(qiáng)烈的長(zhǎng)時(shí)間照明進(jìn)行激發(fā)，可以大大增加信號(hào)強(qiáng)度。在固定SARS-CoV-2感染細(xì)胞后，研究人員通過(guò)納米體-StayGold融合的超分辨率體積成像實(shí)現(xiàn)了病毒棘突蛋白的精細(xì)細(xì)胞內(nèi)定位。
圖|通過(guò)快速、可持續(xù)、寬3D-SIM顯示，激動(dòng)劑誘導(dǎo)和拮抗劑誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)縱向變化圖|通過(guò)StayGold SIM技術(shù)可視化細(xì)胞中的SARS-COV-2組件熒光蛋白的光穩(wěn)定性是現(xiàn)代生物成像中最重要的障礙之一，該StayGold展示的性能使可持續(xù)生物成像成為可能，而不受顯著光漂白的限制。該課題組仍在進(jìn)一步開(kāi)發(fā) StayGold 技術(shù)。由于 StayGold 是二聚體，因此正在開(kāi)發(fā)用于蛋白質(zhì)融合應(yīng)用的單體StayGold (mStayGold)。與此同時(shí)，通過(guò)融合熒光蛋白構(gòu)建體的兩個(gè)副本創(chuàng)建了一個(gè)串聯(lián)二聚體 StayGold (tdStayGold)，研究人員成功地將其用于可視化微管相關(guān)蛋白復(fù)合物和興奮性突觸后密度蛋白的動(dòng)力學(xué)。研究人員還通過(guò)進(jìn)一步修飾其氨基和羧基末端來(lái)開(kāi)發(fā)完全融合耐受的 StayGold 變體。目前正在進(jìn)行的晶體結(jié)構(gòu)的研究，將有助于通過(guò)設(shè)計(jì)的誘變來(lái)實(shí)現(xiàn)StayGold的定向進(jìn)化。重要的是要認(rèn)識(shí)到，所有野生型熒光蛋白都經(jīng)過(guò)了廣泛的工程改造，以提高其熒光成像性能。使用基因組編輯技術(shù)將 tdStayGold（或更高版本的 mStayGold）整合到特定位點(diǎn)，將能夠以低拷貝數(shù)定量可視化熒光蛋白標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)跟蹤細(xì)胞中的此類蛋白質(zhì)。研究人員巧取了亮度-光穩(wěn)定性的權(quán)衡，開(kāi)發(fā)出了StayGold，它具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性和出色的亮度，這些特性促使研究人員去思考StayGold如何與O2相互作用，以使生色團(tuán)成熟和分解。一旦對(duì)StayGold獨(dú)特的光穩(wěn)定性機(jī)制有了原子水平的理解，確定光穩(wěn)定性機(jī)制是否可轉(zhuǎn)移到其他流行的熒光蛋白將是一件有趣的事情。Hirano,M., Ando, R., Shimozono, S. et al. A highly photostable and bright green fluorescent protein. Nat Biotechnol (2022).https://doi.org/10.1038/s41587-022-01278-2
