2014年，哈佛大學的Peng Yin和William Shin課題組一起報道了一種叫做DNA-PAINT新的超分辨技術（DOI：10.1038/nmeth.2835）。PAINT（Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography，用于納米形貌成像的點聚集）技術是一個使用快速和瞬態染料一次捕獲多個熒光點的過程。其依賴于熒光分子與配體的隨機動態結合，而不是永久結合的熒光團的隨機光激活。DNA分子的雜交是一個動態平衡的過程，因此帶有熒光基團的DNA被用來實現PAINT的過程，雜交集合到靶標DNA上的熒光探針與游離的熒光探針之間的熒光信號有很大的差異，進而實現了對靶標結構的超分辨成像。然而，常規的DNA-PAINT仍然存在很多限制（圖1a 左上 ）。首當其沖的一點，由于這個方法本身的局限性，DNA-PAINT會存在較強的背景信號，為了盡可能降低這個問題的影響，常規的DNA-PAINT往往會借助TIRF（全內反射）結構光來增加信噪比，這樣的做法會讓成像的范圍局限在玻片的表面，難以實現三維層面的成像。后續人們為了降低背景信號也對這個技術做出了一些改進，例如基于FRET的DNA-PAINT（圖1a 右上）和通過設計含有莖環結構的分子信標來降低未結合探針信號（圖1a 左下）的策略。然而，基于FRET的DNA-PAINT被證實其定位的精度還要低于常規的DNA-PAINT，而基于莖環結構探針的DNA-PAINT會降低探針和靶標結合的速率從而導致成像速率的受到很大的影響。基于以上的背景，來自耶魯大學藥學院的Joerg Bewersdorf教授和他的合作者們一起提出了一種簡單有效的Fluorogenic DNA-PAINT策略來改進現有的DNA-PAINT技術以實現更快更高分辨成像的目的。
他們的方案如圖1a 右下所示。他們的設計原理與此前的莖環結構分子信標類似，通過在DNA鏈的兩端分別修飾熒光基團（Cy3B）和淬滅基團（BHQ2），對沒有結合到靶標上的探針而言，淬滅基團會很大程度上降低其熒光信號從而提升信噪比。與此前的莖環結構不同，他們的探針并沒有去設計這種二級結構，但由于單鏈DNA本身是柔性分子，因此自由狀態下探針的熒光信號會得到很大程度上降低，如圖1b所展示的，在未結合狀態下探針的信號不足結合狀態下探針信號的2.5%。也正因為沒有二級結構的存在，探針和靶標的結合速率相比此前具有莖環結構的探針而言會快很多從而在一定程度上提升了成像速率。為了保證結合上去的探針可以正常發光，就必須保證結合狀態下淬滅基團和熒光基團之間具有足夠的間距。這就對互補靶標和探針分子互補配對區域的長度有了一定的要求，理論上至少需要15個堿基對的長度。但是想實現高速成像需要靶標和探針配對區域短于10個堿基對的。為了同時實現高速結合以及高效發光，他們在配對區域之中引入了一些錯配，在保證間距的同時也進一步提高了結合速率。如圖2所示，他們分別用他們的方案和常規DNA-PAINT對固定的微管進行成像，原本需要8小時的成像用Fluorogenic DNA-PAINT僅僅20分鐘就可以實現。圖2 常規DNA-PAINT與Fluorogenic DNA-PAINT的對比為了測試他們的系統，如圖3他們首先構建了一個具有48個結合位點的環狀DNA折紙結構并用他們設計的方案對其進行TIRF成像，他們分別在1分鐘，3分鐘，7分鐘的時候采集了圖像，并對結果進行平均之后得到環狀結構的測量直徑是60.5±2.0 nm。這與他們設計的理論值62nm是相吻合的。圖3 Fluorogenic DNA-PAINT對環形DNA折紙結構的高速成像此外，他們想知道他們設計的新系統是否可以擺脫傳統DNA-PAINT必須依賴TIRF結構光的問題，從而實現一定程度上的3維成像。在明場下找到想檢測的區域后，他們可以僅使用10 nM濃度的探針在10分鐘內完成高質量3維微觀網絡的超分辨成像。圖4 不依賴特殊結構光的迅速3維Fluorogenic DNA-PAINT成像為了進一步拓展這個方法用于多色成像，他們設計了另外一組與之前所用探針-靶標相正交的新的探針，并使用ATTO 643和Iowa Black FQ標記新的探針。最終，他們實現了10分鐘之內在U-2 OS細胞中內質網和線粒體的雙色成像，并且沒有借助特殊的光學結構。總的來說，作者在已經現有的DNA-PAINT技術的基礎上通過一些簡單的改動，實現了降低背景信號同時又可以高速成像的目標，并且，該方法可以一定程度上幫助DNA-PAINT擺脫結構光的限制，還可以實現多種靶標的同時成像。也正因為用到的成像鏈對和靶標是部分互補配對的，因此任何一個靶標都可能可以有多種潛在的成像鏈。雖然有諸多優點，但是這個方案也存在其固有的缺點。因為靶標和成像鏈并不完全配對，對一些特定的序列很接近靶標，這個方法或許沒有很好的識別能力。但是瑕不掩瑜，總的來說，這個方案還是對DNA-PAINT技術一個很大的補充。Chung, K.K.H., Zhang, Z., Kidd, P. et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods (2022). https://doi.org/10.1038/s41592-022-01464-9
