熒光納米技術徹底改變了我們可視化（活）細胞的能力，方法是將光學成像的極限擴展到個位數納米分辨率，并通過對具有分子特異性的生物樣品的內部納米級結構和動力學進行微創觀察。這些技術的核心是化學特異性熒光標記和熒光團的熒光（開）和非熒光（關）狀態之間的內在控制。這種連續的開關轉換是在分子級接近分離相鄰熒光團的關鍵。可光活化或caged染料（其中的開關轉換是不可逆的并且由光觸發）使這些納米技術非常強大，因為它們消除了對特定成像緩沖液和高強度紫外光的需求。這些要求在基于單分子的顯微鏡中普遍存在，例如光激活定位顯微鏡 (PALM) 或隨機光學重建顯微鏡 (STORM)，以驅動常用的熒光團（例如，花青）在非熒光和熒光狀態之間，以及實現高密度單粒子跟蹤。最近，光活化染料已被用于減少 DNA-PAINT 中的熒光背景，并增加可通過通道雙工在受激發射損耗 (STED) 顯微鏡中同時成像的細胞結構的數量。
由于其光學和化學性質、細胞膜滲透性、光穩定性和亮度的顯著可調性，羅丹明染料已成為熒光顯微鏡和納米顯微鏡中應用最廣泛的一些熒光團。特別是，硅羅丹明通常因其固有的紅移發射、熒光行為和活細胞兼容性而受到青睞。然而，已報道的羅丹明封閉策略依賴于將染料“鎖定”為非熒光形式，通過在氮原子上安裝光不穩定保護基團（例如與硝基戊酰氧基羰基或亞硝基基團）或通過內酯環的合成轉化成相應的環狀α-重氮酮。前一種策略限制了可達到的取代模式，降低了水溶性，并在光活化時產生化學計量的潛在有毒副產物。同時，后一種策略受到不同的解封效率和伴隨形成的非熒光副產物的影響，其豐度取決于介質和替代模式。
因此，在熒光顯微鏡和納米顯微鏡應用中非常需要無caging基團、緊湊的可光活化和生物相容的熒光團，只要光活化快速、完全且不含副產物，就可以實現低分子量標記。
鑒于此，馬克斯-普朗克研究所Stefan W. Hell、Alexey N. Butkevich等人描述了一種將 3,6-二氨基氧雜蒽酮（3,6-diaminoxanthones）轉化為無caging基團的可光活化熒光團的通用方法。這些可光活化的氧雜蒽酮 (photoactivatable xanthones, PaX) 在光照射后迅速而干凈地組裝成高度熒光、光和化學穩定的派若寧染料。成果發表在Nature Chemistry上。
在尋找簡約的可光活化熒光團時，研究人員推斷采用光化學反應組裝或“鎖定”熒光團的概念，而不是“解鎖”可光裂解的caging元件，將為caged羅丹明染料提供一種改進的替代品——一種類似于光致變色二芳基乙烯的策略。這些可光活化的PaX染料可以通過簡單有效的三步合成路線從現成的起始材料制備，還與碳橋和硅橋接類似物兼容，從而產生一系列跨越大部分可見光譜的熒光團。
特別是，PaX 衍生的 Si-pyronine 染料顯示出良好的活細胞相容性、對親核試劑的彈性以及對橙色發射（TAMRA 樣）熒光團前所未有的光穩定性。在一個或兩個光子活化下，這些化合物迅速組裝成高度光穩定的熒光吡喃染料。通過改變 PaX 染料的取代模式，可以調整光活化動力學以及光譜特性，從而實現多路復用偽彩色和傳統的多色成像。
圖|PaX 染料的設計、合成和表征
研究人員還強調 PaX 染料和標簽在光學顯微鏡和納米技術、固定細胞和活細胞中的實用性，包括 STED、光激活定位顯微鏡 (PALM) 和最小光子通量 (MINFLUX)。
圖|在活細胞中使用可光激活 PaX 標簽進行成像
圖|使用 PaX 560對 NPC 進行 MINFLUX 成像
綜上所述，本文為無caging基團、明亮和活細胞兼容的光活化染料引入了通用設計策略，適用于廣泛的光學顯微鏡和納米技術，包括 PALM、STED 和 MINFLUX。預計該方法將進一步刺激用于生物成像和材料科學的光活化探針和傳感器的發展。PaX 熒光團的進一步改進將有利于 MINFLUX 成像和最近提出的 MINSTED 納米顯微鏡的應用。
參考文獻：
Lincoln, R., Bossi, M.L., Remmel, M. et al. A general design of caging-group-free photoactivatable fluorophores for live-cell nanoscopy. Nat. Chem. (2022).
https://doi.org/10.1038/s41557-022-00995-0
