相信絕大多數(shù)生物相關的科研人都逃不過養(yǎng)細胞的宿命，這么多年來一邊念著速溶慢凍慢凍速溶，一邊加入10%的DMSO，細胞凍存復蘇就完事了。但是，你有沒有經(jīng)歷過凍存復蘇起來的細胞活力很差或者它分化了？你有沒有思考過，你心愛或恨得牙癢癢的細胞在冰箱里面到底經(jīng)歷了什么？這么多年，凍存細胞和組織真的凍對了嗎？低溫保存，即在零度以下溫度下儲存材料的過程，是基礎研究以及臨床、生物醫(yī)學和食品科學的重要過程。但是低溫不是冷凍保存引起的損傷的直接原因，而是冷凍和解凍過程出現(xiàn)多種現(xiàn)象對材料造成損害。為了緩和冷凍保存引起的損傷，采用冷凍保護劑（CPA），最常見的是二甲基亞砜（DMSO）和甘油。盡管它們具有實用性，但這些常見的冷凍保護劑給被冷凍的生物材料帶來了許多問題，并且某些細胞類型仍然難以冷凍保存和恢復，抑或是引發(fā)了多潛力細胞分化。總體而言，目前設計和發(fā)現(xiàn)新型冷凍保護劑的需求顯然尚未得到滿足，這些冷凍保護劑可以取代或減少這些當前金標準所需的量，并解決具有挑戰(zhàn)性的樣品類型。近日，英國華威大學化學系的Kathryn A Murray教授與生物醫(yī)學系的Matthew I Gibson 教授批判性地討論了冷凍保存的方法，總結了細胞冷凍保存過程中復雜且關鍵的損傷途徑以及解決方法。二人重點介紹和評估當前和新興的化學工具，包括冰結合劑、冰成核劑，、冰成核抑制劑和生化調(diào)節(jié)相關的新興材料，這些工具可以調(diào)節(jié)低溫保存過程。此外，也討論利用化學工具的具體方法，例如細胞封裝和生化途徑的調(diào)節(jié)。最后，介紹領域發(fā)展并提出將使該領域受益匪淺的新方法。在大多數(shù)情況下，將水溶液冷卻到平衡冰點以下將不可避免地導致細胞外介質(zhì)中冰晶的形成和樣品中水溶劑量的降低，這將導致兩個關鍵影響。首先，在細胞膜上形成滲透梯度，導致細胞脫水。一些細胞脫水有利于冷凍保存結果，因為它減少了細胞內(nèi)冰晶（IIF）。然而，不成比例的脫水也會導致不可逆的損傷，并且是冷凍保存引起的生物材料損傷的關鍵原因。第二個，隨著冰晶在細胞外介質(zhì)中繼續(xù)生長，先前分散在溶劑中的溶質(zhì)集中在冰晶之間的殘余水通道中。與沒有冰的樣品溶液相比，被困在這些通道中的細胞將經(jīng)歷更高濃度的溶質(zhì)，最終導致滲透性休克或受到毒性損傷。冷凍保存的一個挑戰(zhàn)是樣品過冷，即在（非均質(zhì)）細胞外冰成核發(fā)生之前，溶液的溫度冷卻到比平衡熔點低許多度。當成核時，放熱過程導致潛熱被釋放，從而使溶液升溫接近熔點，同時溶液溫度繼續(xù)降低。因此，由于先前的過冷溶液重新調(diào)整到平衡溫度，因此與在較高溫度下成核的溶液相比，它經(jīng)歷了更快的冷卻過程，其細胞脫水時間也有所不足。另一個挑戰(zhàn)是冷卻速率，冷卻速度慢讓細胞有足夠的時間脫水并防止IIF，然而，細胞也會長時間暴露于高溶質(zhì)濃度以及毒性的冷凍保護劑中。相比之下，冷卻速率快避免細胞在高溶質(zhì)溶液中受損，但可能導致IIF。值得一提的是，不同的細胞類型將具有不同的最佳冷卻速率。當將生物材料解凍時，還存在額外的冷凍保存挑戰(zhàn)。在這個過程中，脫水細胞暴露于大量水或緩沖溶液會導致水流入細胞膜，并可能導致腫脹和細胞裂解。冰重結晶現(xiàn)象也可能發(fā)生，其中冰晶以犧牲較小的晶體為代價生長成較大的晶體，導致機械和滲透應力損傷。玻璃化冷凍是可以通過極高的冷凍速率以繞過結冰過程，進而防止冰成核與細胞內(nèi)冰生長引發(fā)的細胞損傷。為了實現(xiàn)玻璃化冷凍，通常需要高濃度的滲透和非滲透CPA（例如，乙二醇、二甲基亞砜和高分子量試劑）。這種方法的一個主要挑戰(zhàn)是冷凍保護劑的毒性，以及需要快速但逐步地去除CPA，以避免解凍后毒性和滲透損傷。學界基此提出了降低CPA毒性的解決方案，通過實驗篩選出總體濃度較高但內(nèi)在毒性低于標準玻璃化溶液的新型玻璃化溶液。有趣的是，玻璃化中使用的一些滲透性冷凍保護劑（例如甲酰胺）的毒性可以通過添加DMSO，尿素和乙酰胺等化合物來降低，這種方法被稱為冷凍保護劑毒性中和。一些初步研究證實，小分子方法可以幫助解決冷凍保護劑毒性問題。除了減輕毒性之外，還探索了降低CPA總濃度的方法。在小體積體系中，熱擴散距離較短，因此在低CPA濃度下可以實現(xiàn)較高的冷卻速率，允許在玻璃化轉變溫度（Tg）以下快速冷卻，從而不會發(fā)生成核。這種方法在科研應用方面顯示出巨大的潛力，但對于需要大量細胞的細胞治療應用可能沒有用處。重結晶描述了已經(jīng)凍結的材料中冰晶尺寸隨時間推移的增加，這種現(xiàn)象是解凍階段細胞死亡的一個因素。在討論冰重結晶抑制用于冷凍保存時，重要的是要注意“什么程度的抑制才能帶來好處？”是一個具有挑戰(zhàn)性的問題，因為任何藥物都可以具有多種作用模式，這些模式可能因不同的細胞系，冷凍保護劑類型，冷凍/解凍循環(huán)以及任何冷凍保存程序中的其他變量而異。更加增加復雜性的是，冰重結晶抑制是一個連續(xù)過程，而不是on/off屬性，任何材料都可以在足夠高的濃度下減緩冰的生長。目前已知多種抑制冰重結晶活性的冰結合蛋白，其中抗凍糖蛋白的抑制效果可以領先最活躍的合成冰重結晶抑制劑（IRIs）多個幾個數(shù)量級。基于此，嘗試簡化抗凍糖蛋白，僅合成其發(fā)揮作用糖肽的IRI是一次富有潛力的嘗試。除此之外，受到低溫保存的這些正面結果的啟發(fā)，越來越多的新分子和聚合物正在開發(fā)中，以用來抑制冰重結晶活性。這些包括納米材料、有機金屬自組裝、自組裝有機染料、肽和尼龍-3基聚合物。最后，冰重結晶抑制通過減少凍融過程中的不可逆聚集來幫助蛋白質(zhì)冷凍保存，但到目前為止，只有PVA和自組裝肽被證實有效。在冷凍保存溶液中廣泛包含大分子，如聚合物、蛋白質(zhì)和/或多糖。例如，羥乙基淀粉用作紅細胞保護劑，并將血清蛋白、右旋糖酐或PEG等添加到冷凍保護劑溶液中。近年，人們對發(fā)現(xiàn)新的合成和天然聚合物的興趣達到了頂峰，這些聚合物可以取代或減少有機溶劑的數(shù)量，并增加解凍后的產(chǎn)量，包括那些不具有特定冰結合或冰重結晶抑制活性的聚合物。研究表明，具有混合陽離子和陰離子側鏈的聚合物才是功能的關鍵，而不是使用特定聚合物。聚兩性離子體通過控制冰重結晶抑制發(fā)揮作用，但與有效的IRI相比，這種活性的幅度非常低。盡管活性較低，但其的表現(xiàn)仍優(yōu)于冰重結晶抑制材料，可以在玻璃化和慢速冷凍中發(fā)揮作用。聚兩性離子體的一個關鍵考慮因素是它們不是DMSO的替代品。當將聚兩性離子體與DMSO一起冷凍保存會使細胞的解凍后活力更高，但在沒有任何DMSO的情況下受到嚴重限制。這種觀察到的效果意味著聚兩性離子體和滲透性冷凍保護劑（如DMSO）之間存在協(xié)同作用模式。如前所述，樣品過冷導致其中溶液在冰成核之前冷卻遠低于其平衡熔化溫度，是冷凍保存中的常見問題。該過程對于小體積體系尤其明顯。控制成核并在接近零的溫度下誘導成核已被證明可以提高細胞凍存后恢復，通過讓細胞有足夠的時間脫水，從而避免IIF。在此提出兩種方法概念：外部誘導和使用冰成核劑。雖然冰霧與液氮蒸氣誘導成核已經(jīng)被證明有著促進冷凍保存的作用。但在冷凍保存方案中，受控成核經(jīng)常被忽視，這可能是因為包括成核控制在內(nèi)的程序可能很麻煩且復雜。例如，物理方法，如冰播種、電冷凍和沖擊冷卻需要直接干預材料，需要在冷卻曲線期間準確使用它們，并且也難以自動化和擴產(chǎn)。可以添加到培養(yǎng)基中的冰成核劑提供了一種更有前途的替代方案，因為它們不需要特定的施用時間，可以應用于自動化工作流程，并且與一系列冷凍保存容器兼容。結晶膽固醇已被證明可以使溫度高達-4°C的冰成核。其他類固醇，包括睪酮和雄甾酮，也被證明可以在相對較高的溫度（~-7°C）下使冰成核，盡管它們在冷凍保存應用中的使用受到限制。已知幾種細菌物種會產(chǎn)生冰成核蛋白。研究最多的細菌蛋白提取物之一來自丁香假單胞菌，它的促進冷凍保存的作用已經(jīng)在胚胎實驗中被證實，然而，其生物相容性問題仍有待解決。從歷史上看，生物制劑的冷凍保存被視為一個純粹的物理問題，其解決方案側重于控制和調(diào)節(jié)冰的生長/成核，解決滲透變化和細胞脫水或改變冷凍率以提供更好的結果。然而，冷凍保存越來越多地從生化的角度來看待，因此可以通過調(diào)節(jié)生化途徑來減輕冷應激。在大自然中，已知許多微生物產(chǎn)生和積累小分子滲透液，如海藻糖和脯氨酸以對抗低溫暴露。這些小分子滲透液具有物理保護作用，但也有證據(jù)表明其中一些也起著生化作用。使用脯氨酸喂養(yǎng)的果蠅幼蟲更易凍存復蘇。冷凍前24小時用海藻糖或L-脯氨酸的預孵育也被證實在多個細胞系中促進冷凍保存。小分子滲透性的實際效果似乎已經(jīng)明確，但確切的作用方式仍然未知。了解滲透壓解質(zhì)生化作用背后的機制將是未來冷凍保護劑開發(fā)的關鍵。細胞凋亡是程序性細胞死亡的過程，而解凍后延遲發(fā)作的細胞凋亡也是影響細胞復蘇后活力的主要因素之一。半胱天冬酶蛋白是已知的細胞凋亡效應因子，因此假設在冷凍保存培養(yǎng)基中加入半胱天冬酶抑制劑以改善結局。將半胱天冬酶-1抑制劑V添加到HeLa，Jurkat和293個腎癌細胞的冷凍和解凍溶液中，導致存活率顯著提高。這些發(fā)現(xiàn)后來在牛胚胎、豬肝細胞，原代人肝細胞和卵巢組織中得到了復刻。半胱天冬酶抑制劑似乎通過內(nèi)在（線粒體）和外在（死亡受體）途徑影響了細胞解凍后的凋亡過程，這可能解釋了為什么在廣譜抑制劑存在下細胞活力得到改善，而不是特定的半胱天冬酶抑制劑。Rho相關卷曲激酶（ROCK）活性位點抑制劑Y-27632能夠減少hESC中解離誘導的細胞凋亡。鑒于懸浮液中冷凍保存的貼壁細胞類型需要在解凍后重新附著在底物上才能存活，這一發(fā)現(xiàn)為靶向可改善解凍后細胞功能的“可藥物化”途徑提供了機會。當Y-27632補充到hESC的冷凍培養(yǎng)基中時，解凍后細胞回收率比未處理的對照提高了50%175并且還導致細胞粘附增加。當Y-27632單獨添加到解凍培養(yǎng)基中時，hESC集落形成顯著增加，這表明主要影響不是在冷凍保存過程中，而是在解凍過程中。雖然ROCK抑制劑不是傳統(tǒng)定義中的冷凍保護劑，但它們可以通過調(diào)節(jié)生化途徑而不是冷凍保存過程本身來改善生物材料解凍后結局。值得注意的是，不同的細胞類型會有不同的生化途徑。因此，冷凍保存的生化方法可能是細胞依賴性和組織依賴性的，而不是通用性的解決方案。冷凍保存技術現(xiàn)在并且將來都是生物醫(yī)學發(fā)現(xiàn)和轉化科學的重要工具。不再滿足與二甲基亞砜和甘油基礎性方案，更新?lián)Q代的細胞/組織模型和療法將需要同樣先進的凍存工具：保護珍貴的生物樣本；最大化恢復/功能；并確保低溫保存方法符合冷鏈需求。2019冠狀病毒疾病大流行更是特別強調(diào)了后一點，mRNA疫苗有嚴格的冷鏈儲存要求。在這篇綜述中，兩位作者介紹了如何開發(fā)新的化學工具來應對低溫保存的挑戰(zhàn)。還描述了這個多變量問題的復雜性質(zhì)，其中需要解決多種損傷機制，并且細胞類型和冷凍方法（慢速和快速）之間存在細微差異。極端低溫環(huán)境的微生物給予了學界啟發(fā)，讓學者們從天然化合物中發(fā)現(xiàn)對抗低溫損傷的秘密。為了應對這些挑戰(zhàn)，需要一種真正的跨學科方法，兼容結構和進化生物學、合成和分析化學、材料發(fā)現(xiàn)和細胞生物學在內(nèi)的諸多學科。還需要為感興趣的問題找到合適的材料。在這個不斷發(fā)展的領域中，很明顯，僅靠偶然發(fā)現(xiàn)是不可能的。因此，必須采取合理科學的發(fā)現(xiàn)方法，解決具體機制。Kathryn A Murray, Matthew I Gibson. Chemical approaches to cryopreservation. Nat Rev Chem. 2022 Jul 18;1-15.https://www.nature.com/articles/s41570-022-00407-4
