胚胎干細胞（ESC）可以在體外經歷哺乳動物胚胎發生的許多方面，但它們的發育潛力通過與胚胎外干細胞（包括滋養層干細胞 TSC、胚胎外內胚層干細胞和誘導型 XEN細胞）的相互作用而大大擴展。在自然發育過程中，合子發育成外胚層，形成生物體；胚胎外內臟內胚層（VE），對卵黃囊起作用；以及胚胎外胚層（ExE），其有助于形成胎盤。與這三個譜系相對應的干細胞提供了多種成分，這使人工胚胎發育程度有可能向前邁出一步。來自英國劍橋大學與美國加州理工學院的Magdalena Zernicka-Goetz帶領其團隊利用小鼠ESCs、TSCs和iXEN三種細胞體外組裝了干細胞衍生胚胎，并表明它們再現了8.5天子宮內的整個自然小鼠胚胎發育。該胚胎模型顯示了定義上的前腦和中腦區域頭褶，并形成了跳動的心形結構，包括神經管和體節的軀干，含有神經中胚層祖細胞、腸道和原始生殖細胞的尾芽。這個完整的胚胎模型在胚胎外卵黃囊內發育并形成血島。重要的是，作者團隊證明了由Pax6敲除胚胎干細胞與野生型TSC和iXENs聚集而成的神經發育胚胎模型再現了天然存在的Pax6基因敲除胚胎中發生的神經管腹側結構域擴張。因此，這些完整的胚狀體是剖析不同譜系和基因在發育中的作用的強有力的體外模型。該結果證明了胚胎和兩種類型的胚胎外干細胞的自組織能力，通過原腸胚形成、神經形成和早期器官發生來重建哺乳動物的發育過程。作者團隊接種了ESCs、TSCs和iXEN細胞，使其自組裝，并在第4天將具有正確植入后形態的ETiX胚胎狀體轉移到懸浮培養中（圖1a）。在第5天，ETiX胚狀體具有前羊膜腔（由ESC和TSC隔室中的腔合并而成）、完全遷移的AVE（在ESC和TSC隔室的邊界處）和原腸胚（如上皮到間充質的過渡以及ESC和VE樣層之間細胞層的形成所示）ETiX胚狀體原腸胚與天然原腸胚極為相似（圖1b，c），盡管ETiX胚胎狀體在大小上表現出更大的變異性。引人注目的是，在第7天，在靜止條件下培養的神經發育ETiX胚狀體顯示出前后軸，分叉的神經褶皺延伸到神經管中并最終形成尾芽，其形態類似于E8.0自然胚胎的早期頭褶階段。在此之后，尾芽與尿囊組織連接，尿囊組織與發育中的絨毛膜連接（圖1c）。這些條件允許ETiX胚狀體在原腸胚形成和神經形成之后發育。正如預期的那樣，隨著時間的推移，ETiX胚胎表現出細胞類型復雜性的增加，相應于分化組織和器官的形成。重要的是，所有已鑒定群體的細胞類型復雜性和時空成熟度的增加在自然和ETiX胚胎中具有可比性，表明神經發育胚胎遵循類似的發育時間線。例如，兩個系統都顯示了三個胚層及其衍生物（神經外胚層、表面外胚層和腸道祖細胞）的發育，器官發生（心肌細胞）的開始，以及羊膜和尿囊等胚胎外組織的形成。神經發育胚狀體概括了神經發育胚的多個組織產生，這不僅通過其形態，而且還通過其細胞類型特異性基因表達表現出來。為了檢測胚狀體中的神經發育，通過免疫熒光分析了成熟的神經外胚層標記物的表達。Sox1和Sox2在第7天沿神經發育胚狀體的整個前后軸以類似于自然E8.0胚胎的模式在神經上皮細胞群中表達（圖2a，b）。有助于中腦和前腦形成的轉錄因子Otx2在神經發育第8天ETiX胚胎的頭褶的最前三分之一中顯示出限制性表達（圖2d，e）。該區域對應于E8.5處的天然小鼠胚胎的前腦和中腦。神經發育第8天胚胎體也在與天然E8.5胚胎相同的區域表達轉錄因子FoxG1，該轉錄因子在大腦發育中發揮重要作用（圖2d、e）。由Otx2表達劃分的大腦區域在自然胚胎和ETiX胚狀體中相似。第8天神經發育胚狀體的神經管閉合，并在神經管內顯示出不同的神經祖細胞結構域。Foxa2在神經管腹側中線的細胞中表達，標志著底板細胞群（圖2f），而Pax3在背側神經管、體細胞中胚層和神經嵴細胞中表達（圖2f）。Sox10表達證實了神經嵴細胞的身份，這些細胞從神經管中移位，好像經歷了自然大腦發育過程中發生的分層和遷移（圖2f）。為了測試神經發育胚狀體的神經管是否以與自然胚胎的神經管相同的方式響應發育，用不表達Pax6的轉基因ESC系中生成了胚狀體。與Pax6敲除天然胚胎的發育一致，Pax6基因敲除胚狀體在神經外胚層中Sox1陽性細胞的總數沒有變化，但顯示Nkx2.2陽性細胞的比例增加，表明神經管的腹側結構域擴大（圖3a，b）。為了確定Pax6缺失的其他發育后果，檢查了在沒有Pax6的情況下轉錄水平的整體變化，發現與神經元形成、軸突發育和形成相關的轉錄物富集（圖3c），與已發表的結果一致。在自然胚胎發生過程中，神經中胚層祖細胞（NMPs）與神經管和近軸中胚層的衍生物相關。NMP標記物Sox2和Brachyury在跨越神經發育第8天ETiX胚胎的尾芽后部區域的結構域中表達（圖4a）。軸旁中胚層產生體細胞，體細胞是沿著胚胎的前后軸形成的成對細胞塊，是骨骼肌、血管和皮膚的節段形成所必需的。在第7天ETiX胚狀體和自然E8.0胚胎中，在Sox1/Sox2陽性神經管群的兩側觀察到表達同源盒蛋白HoxB4的體細胞對（圖4c、d）。ETiX胚狀體和自然胚胎中體細胞的數量和面積的定量顯示兩者之間沒有顯著差異（圖4e，f）。原腸胚形成的原始條紋中也出現了一組獨特的細胞，這些細胞將要形成心臟。在自然胚胎中，這一發育事件發生在E8.0左右，當心臟中胚層分化為心肌細胞時，心跳繼以出現。成功觀察到第8天神經發育胚狀體中腦區下方形成搏動結構。神經發育胚狀體的該搏動區域以與自然胚胎相似的時空分布表達心臟發育所需的肌球蛋白重鏈II（Myh2）和轉錄因子Gata4（圖4g，h）。第8天神經發育胚胎中所示切片的免疫染色顯示Nkx2.5、Gata4和Myh2三重陽性（圖4i，j）。但是與自然胚胎相比，ETiX類胚胎的心臟結構域面積減少。在觀察到外胚層和中胚層的廣泛發育和形態發生后，神經發育胚狀體顯示出內胚層的發育，從而形成腸道和相關器官。E8.5自然胚胎和第8天ETiX胚狀體的矢狀截面顯示存在前腸和后腸袋（圖5a，b）。除了在大腦和神經管中表達外，轉錄因子Sox2也在自然胚胎的前腸中表達，這種表達模式在神經發育胚狀體中是保守的（圖5a，b）。同樣，Sox17在自然胚胎和神經發育胚狀體的后腸中表達（圖5a，b）。然而，在觀察的時間范圍內，ETiX類胚胎的腸道發育不如自然胚胎廣泛。雖然Gata4在自然胚胎和ETiX胚狀體的心臟中同樣顯著地表達，但它在自然胚胎的后腸中表達，但在ETiX胚胎狀體中不表達（圖5a，b）。scRNA分析、RNA速度分析與潛伏期分析綜合表明，ETiX胚狀體的腸道形成可能與其自然對應體的時間相似，但在發育軌跡上存在一些差異。原始生殖細胞（PGC）出現在外胚層的近端-后部區域，大約與E6.5小鼠胚胎中開始表達的時間相同。以Stella表達為特征，在第6天ETiX胚狀體的ESC-TSC邊界檢測到該表達，類似于E7.5自然胚胎（圖5e）。在ETiX胚狀體發育的后期時間點也可檢測到PGC。在第7天和第8天，在ETiX胚狀體的尿囊附近發現PGC，類似于E8.0時的自然胚胎。無法在單細胞數據集中檢測到PGC，這可能反映了它們的數量非常低。ETiX胚狀體在類似羊膜和卵黃囊的膜內發育，為胚胎提供營養，直到胎兒-母體循環建立。在發育過程中，卵黃囊分別來源于壁內胚層和內臟內胚層（VE）。在ETiX胚狀體中發育的卵黃囊的胚外部分附著在類似絨毛膜和尿囊的結構上（圖6e）。卵黃囊支持胚胎中的原始造血，引人注目的是，在第8天，在神經發育胚狀體的卵黃囊中胚層和尿囊底部觀察到Runx1陽性血島（圖6f）。最后，作者團隊探究確定ETiX胚狀體是否也能發育形成功能性胎盤所需的細胞群。在ETiX胚狀體中，可以觀察到滋養層前體的持續存在，就像在自然胚胎中一樣，分裂成ECP和絨毛膜譜系；然而，后者沒有與自然胚胎的絨毛膜譜系完美地聚集（圖6g，h）。此外，由于ECP基因的表達改變或缺失，ETiX胚狀體中的ECP譜系未完全發育，催乳素基因表達的缺失表明滋養層巨細胞和海綿滋養層細胞缺失（圖6i，j）。該分析表明，雖然絨毛膜譜系的發育已基本完成，但源自ECP的胚外譜系在ETiX胚狀體中基本缺失。在這里，作者團隊展示了組裝小鼠胚胎和胚胎外干細胞以形成胚胎模型，允許人工胚胎發育大腦、神經管、心臟、前腸、體節、尿囊、原始生殖細胞和卵黃囊結構。這種胚胎模型能夠完全通過這三種類型干細胞的自組織實現這一點，而不需要提供任何額外的外部信號誘導。與其他干細胞衍生的胚胎模型不同，神經發育胚狀體以與自然胚胎非常相似的方式進行頭褶結構的形態發生。這些事件一起使原始條紋之前的區域能夠正確地引導前腦和中腦的形成。ETiX胚狀體的自然原腸胚化運動使其能夠進行神經形成，形成神經管，開始體細胞發生，并產生包括心形結構在內的中胚層結構。雖然ETiX胚狀體的胚胎譜系非常接近自然發育，但胚外譜系顯示出一些偏差。這可能與缺乏與母體環境的接觸相關。將胚胎干細胞重新編程為滋養層/滋養層譜系是生成完整胚胎模型的一種有價值的解決方法，但目前研究進展被限制，仍然需要進一步優化。重要的是，作者團隊能夠在神經發育胚狀體中復制Pax6敲除的結果，這說明了這種完整胚胎模型在不需要實驗動物的情況下剖析調節發育的遺傳因素的潛力。預計該系統將廣泛應用于解剖學分子途徑研究和篩選影響胚胎發生的化學物質。由于ETiX胚狀體模型囊括了發育的諸多生理過程，因此它們為揭示發育和疾病機制提供了重要平臺。
Gianluca Amadei, Charlotte E Handford, Chengxiang Qiu, et al. Synthetic embryos complete gastrulation to neurulation and organogenesis. Nature. 2022 Aug 25.
https://www.nature.com/articles/s41586-022-05246-3
