炎癥與中風(fēng)、心肌病和癌癥等疾病密切相關(guān)。炎癥過(guò)程監(jiān)測(cè)對(duì)于疾病早期診斷和干預(yù)具有重要意義。然而，常規(guī)臨床診斷方法只能對(duì)單個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量，無(wú)法實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)炎癥過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，RNA在炎癥的起始、發(fā)展和消退中發(fā)揮重要作用，是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。因此，利用RNA為標(biāo)志物對(duì)炎癥進(jìn)行原位成像具有重要意義。近年來(lái)，DNA生物技術(shù)的發(fā)展為放大RNA檢測(cè)信號(hào)提供了有力工具，被用于細(xì)胞內(nèi)RNA高靈敏檢測(cè)和成像。然而，這些信號(hào)放大策略往往缺乏空間分辨率和細(xì)胞選擇性，易在正常組織中產(chǎn)生非特異性的信號(hào)倍增，制約其在體成像應(yīng)用。分子信標(biāo)（MB）為RNA分析提供了一種直接且廣泛適用的工具。開(kāi)發(fā)MB輔助信號(hào)放大技術(shù)可以有效提高靈敏度，然而，該技術(shù)尚未應(yīng)用于活體動(dòng)物的RNA成像。近日，國(guó)家納米科學(xué)中心的李樂(lè)樂(lè)研究員在趙宇亮院士的支持下，率領(lǐng)其團(tuán)隊(duì)報(bào)告了一種利用嘌呤/嘧啶缺失位點(diǎn)分子信標(biāo)的炎癥相關(guān)信使RNA（mRNAs）成像設(shè)計(jì)，其熒光信號(hào)的放大由人嘌呤/嘧啶缺失核酸內(nèi)切酶1在從炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)時(shí)觸發(fā)。通過(guò)小鼠腳部急性炎癥和藥物誘導(dǎo)肝臟炎癥模型，評(píng)估了針對(duì)小鼠活體的白細(xì)胞介素-6（IL-6）mRNA工程化分子信標(biāo)的敏感性和組織特異性。這種酶擴(kuò)增策略可以在體內(nèi)對(duì)其他疾病相關(guān)RNA進(jìn)行特異和敏感的成像。
作者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種人嘌呤/嘧啶缺失核酸內(nèi)切酶1（APE1）觸發(fā)的分子信標(biāo)（MB）探針（E-MBP），用于體內(nèi)RNA的特異性放大成像，從而能夠直接評(píng)估炎癥。APE1是一種多功能酶，通過(guò)去除無(wú)嘌呤/嘧啶（AP）位點(diǎn)來(lái)修復(fù)DNA損傷。其信號(hào)放大機(jī)制在于 MB的RNA靶向性與針對(duì)炎性細(xì)胞選擇性切割。E-MBP是通過(guò)將兩個(gè)AP位點(diǎn)合并到MB的發(fā)夾環(huán)中，同時(shí)其莖末端用熒光團(tuán)和猝滅劑標(biāo)記，由于F?rster共振能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致低熒光背景。當(dāng)一個(gè)E-MBP與一個(gè)靶RNA雜交時(shí)，APE1形成兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)以切割信標(biāo)鏈，同時(shí)釋放靶RNA以進(jìn)行下一個(gè)周期。在多次循環(huán)后，一個(gè)靶RNA可以誘導(dǎo)許多E-MBP的切割，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。此外，由于APE1可從炎性細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，E-MBP在炎性細(xì)胞中的熒光信號(hào)比正常細(xì)胞中的信號(hào)更加明顯，從而顯著提高成像靈敏度和細(xì)胞特異性。
與常規(guī)MB一樣，設(shè)計(jì)用于與靶mRNA雜交的E-MBP環(huán)長(zhǎng)24個(gè)堿基，莖包含6個(gè)堿基對(duì)。在E-MBP環(huán)部的兩個(gè)AP結(jié)合位點(diǎn)是APE1介導(dǎo)信號(hào)放大的關(guān)鍵。在選擇靶mRNA結(jié)構(gòu)域時(shí)需要考慮兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。首先，為了最大限度地減少與非靶mRNA的假結(jié)合，通過(guò)基本局部比對(duì)搜索工具（BLAST）分析選擇IL-6 mRNA特有的序列。其次，由于mRNA通常形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能限制MB對(duì)靶序列的可訪問(wèn)性，應(yīng)當(dāng)選擇不在這種二級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)的合適目標(biāo)域。在沒(méi)有APE1激活的情況下，在添加IL-6 mRNA的情況下觀察到E-MBP的輕微熒光增加。相反，當(dāng)存在靶mRNA時(shí)，APE1激活E-MBP時(shí)，熒光強(qiáng)度增加17倍，表明APE1介導(dǎo)的信號(hào)放大。E-MBP熒光強(qiáng)度的增加顯示了APE1 mRNA的濃度依賴性。此外，該方法具有足夠高的特異性以將靶RNA與其他RNA區(qū)分開(kāi)。為了證實(shí)信號(hào)放大是由于APE1介導(dǎo)的AP位點(diǎn)的切割，設(shè)計(jì)了與E-MBP具有相同序列但其環(huán)內(nèi)沒(méi)有AP位點(diǎn)的常規(guī)MB探針（表示為MBP）。在MBP中未觀察到APE1輔助信號(hào)放大，證實(shí)了AP位點(diǎn)在該設(shè)計(jì)中的關(guān)鍵作用。此外，當(dāng)選擇IL-6mRNA的兩個(gè)其他結(jié)構(gòu)域用于MBs設(shè)計(jì)時(shí)，也可以實(shí)現(xiàn)APE1介導(dǎo)的信號(hào)放大，證明了該方法的普遍性。圖 體外APE1激活信號(hào)放大策略的評(píng)估用脂多糖（LPS）預(yù)處理Raw264.7巨噬細(xì)胞以建立炎癥M1樣巨噬細(xì)胞。將E-MBP/V應(yīng)用于未經(jīng)LPS處理的細(xì)胞導(dǎo)致最小細(xì)胞熒光信號(hào)。相反，在LPS預(yù)處理的細(xì)胞中觀察到明顯更高的熒光信號(hào)。使用MBP/V（無(wú)AP識(shí)別位點(diǎn)）在活化的巨噬細(xì)胞中顯示出比E-MBP/V低得多的熒光強(qiáng)度，證實(shí)了E-MBP/V對(duì)于增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度的信號(hào)放大能力。作為另一對(duì)照，E-nMBP/V（無(wú)mRNA識(shí)別能力）在炎癥細(xì)胞中顯示了可忽略的熒光信號(hào)，證實(shí)E-MBP/V的細(xì)胞內(nèi)熒光響應(yīng)是由于靶mRNA的特異性識(shí)別。總之，這些結(jié)果確實(shí)證明E-MBP/V對(duì)炎癥細(xì)胞中的擴(kuò)增RNA成像具有顯著的敏感性增強(qiáng)。為了證實(shí)RNA成像確實(shí)來(lái)自轉(zhuǎn)位的APE1對(duì)E-MBP的靶依賴性切割，通過(guò)免疫熒光染色測(cè)量了在有無(wú)LPS刺激的Raw264.7細(xì)胞中APE1的分布。結(jié)果表明，在LPS處理前，APE1主要定位于細(xì)胞核，而在LPS刺激后，APE1在細(xì)胞核中減少，細(xì)胞質(zhì)中增加。這是炎癥細(xì)胞中E-MBP比正常細(xì)胞中特異性信號(hào)放大的關(guān)鍵。為了進(jìn)一步證實(shí)APE1在信號(hào)放大中的作用，使用APE1抑制劑下調(diào)LPS刺激的Raw264.7細(xì)胞中的APE1活性。與未處理細(xì)胞相比，觀察到NCA處理細(xì)胞中熒光信號(hào)明顯降低。這些結(jié)果證實(shí)了炎癥細(xì)胞中APE1的活性對(duì)于細(xì)胞特異性信號(hào)放大至關(guān)重要。圖 炎癥細(xì)胞中IL-6 mRNA的APE1易位介導(dǎo)成像mRNA成像用于體內(nèi)炎癥評(píng)估：通過(guò)在右后爪皮下注射LPS建立小鼠急性腳趾炎癥模型，左后爪注射PBS作為對(duì)照。在用E-MBP/V處理后的不同時(shí)間點(diǎn)收集小鼠的熒光圖像。LPS處理的腳趾顯示出持續(xù)的熒光增強(qiáng)，信號(hào)最大值為30?注射E-MBP/V后5min，而在PBS處理的腳趾中沒(méi)有觀察到明顯的熒光增加。E-MBP/V與兩對(duì)照組（MBP/V和E-nMBP/V）的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。炎癥診斷的挑戰(zhàn)之一是早期檢測(cè)。上述結(jié)果表明，E-MBP/V允許在LPS刺激90min快速成像，以評(píng)估急性腳趾炎癥。該性能與通過(guò)qRT–PCR技術(shù)測(cè)量的mRNA水平可辨別變化的時(shí)間點(diǎn)非常一致。值得注意的是，爪自組織的蘇木精和伊紅（H&E）染色在LPS刺激后90min觀察不出明顯的組織學(xué)變化。這些結(jié)果表明，炎癥相關(guān)RNA的上調(diào)先于組織學(xué)變化，這意味著E-MBP/V在炎癥早期診斷中的潛力。圖 小鼠腳趾LPS刺激炎癥模型體內(nèi)急性炎癥成像mRNA成像用于藥物誘導(dǎo)肝毒性的早期診斷：藥物誘導(dǎo)的肝毒性是一個(gè)常見(jiàn)的臨床問(wèn)題。由于缺乏直接檢測(cè)早期生物標(biāo)志物的方法，目前的肝毒性診斷受到限制。利用對(duì)乙酰氨基酚（APAP）過(guò)量會(huì)導(dǎo)致I期代謝引起的肝毒性，構(gòu)建藥物誘導(dǎo)的肝損傷模型。然后，通過(guò)全身成像研究E-MBP/V的早期檢測(cè)性能。APAP預(yù)處理小鼠的肝臟在成像過(guò)程中信號(hào)逐漸增強(qiáng)，但在用PBS預(yù)處理的對(duì)照組中只觀察到可忽略的熒光變化。同時(shí)，與APAP組相比，用肝臟保護(hù)劑與APAP共處理的小鼠在肝臟成像中也顯示出明顯降低的信號(hào)。此外，比較了APAP治療后E-MBP/V與MBP/V和E-nMBP/V的差異。由于缺乏信號(hào)放大，MBP/V在肝臟中表現(xiàn)出明顯低于E-MBP/V的信號(hào)，而E-nMBP/V沒(méi)有產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)響應(yīng)。肝臟的離體成像中，APAP處理組肝臟中的E-MBP/V信號(hào)比PBS處理組高3.8倍。因此，可以預(yù)見(jiàn)的是酶觸方法能夠?qū)崿F(xiàn)藥物誘導(dǎo)的肝毒性成像信號(hào)放大。圖 APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型早期診斷成像為了比較E-MBP/V與臨床方法的檢測(cè)能力區(qū)別，對(duì)APAP處理后不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織進(jìn)行了組織學(xué)分析。H&E染色顯示，在APAP注射180min后可以觀察到不均勻的肝細(xì)胞形態(tài)和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。通過(guò)血清生化測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)了這種時(shí)間依賴性肝毒性。觀察到丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平顯著升高。接下來(lái)，通過(guò)傳統(tǒng)的qRT-PCR研究了炎癥過(guò)程中靶mRNA的水平。觀察APAP注射30min后可以觀察到IL-6 mRNA顯著增加，表達(dá)水平持續(xù)增加至90注射后90min。此外，隨著NAC的進(jìn)一步處理，靶mRNA顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低。值得注意的是，IL-6 mRNA在不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化與藥物刺激后E-MBP/V的成像結(jié)果良好相關(guān)，證實(shí)該方法可精確區(qū)分藥物誘導(dǎo)肝損傷中的炎癥。對(duì)于基于E-MBP / V的成像檢測(cè)藥物誘導(dǎo)的肝毒性的最早窗口時(shí)間，E-MBP / V在APAP注射后45分鐘顯示出第一個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)變化，這比H&E染色和生化測(cè)定至少早了135分鐘。基于DNA的技術(shù)，如FISH，MB和熒光團(tuán)結(jié)合RNA適配子已被積極用于RNA成像。這些系統(tǒng)通常建立于一對(duì)一的信號(hào)讀出，導(dǎo)致靈敏度不足，無(wú)法準(zhǔn)確成像低表達(dá)水平的RNA。作者團(tuán)隊(duì)展示了一種簡(jiǎn)單而強(qiáng)大的策略，用于疾病部位特異性進(jìn)行信號(hào)放大。E-MBP是通過(guò)將酶促活化的AP位點(diǎn)摻入MB結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的。APE1激活的信號(hào)擴(kuò)增能夠以高靈敏度和空間選擇性對(duì)炎癥相關(guān)RNA進(jìn)行成像。E-MBP需要對(duì)雙重標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)處理，以產(chǎn)生用于檢測(cè)炎癥的放大信號(hào)，其診斷比臨床診斷方法早得多。E-MBP代表了一種信號(hào)擴(kuò)增策略，不僅允許在體內(nèi)進(jìn)行空間控制的RNA成像，而且還有助于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和診斷藥物誘導(dǎo)的毒性。可以預(yù)見(jiàn)的是這種方法的應(yīng)用將擴(kuò)展到不同領(lǐng)域。盡管在檢測(cè)RNA的方法發(fā)展方面取得了巨大進(jìn)展，但活體動(dòng)物中炎癥相關(guān)RNA成像的靈敏和特異性問(wèn)題仍待克服。APE1介導(dǎo)的信號(hào)擴(kuò)增對(duì)炎癥部位具有高空間選擇性，與傳統(tǒng)的MB技術(shù)相比，顯著提高了靈敏度，并且具有檢測(cè)任何目標(biāo)序列的多功能性，為闡明RNA在炎癥進(jìn)展和治療中的生物學(xué)功能提供了獨(dú)特的工具。此外，APE1的表達(dá)和亞細(xì)胞定位的動(dòng)態(tài)改變也在其他疾病中觀察到，包括癌癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病。因此，選擇合適的RNA生物標(biāo)志物，該方法也可能擴(kuò)展到此類疾病的診斷。Chuangui Sheng, Jian Zhao, Zhenghan Di, et al. Spatially resolved in vivo imaging of inflammation-associated mRNA via enzymatic fluorescence amplification in a molecular beacon. Nat Biomed Eng. 2022 Sep 1.https://www.nature.com/articles/s41551-022-00932-z
