生物大分子（DNA、RNA和蛋白質）在合成后以化學基團添加到其殘基的形式進行各種化學修飾。這些修飾作為標記物并攜帶額外的信息來精確調節基因表達。蛋白質翻譯后修飾由于其在細胞調節中的藥理學作用，多年來一直是人們關注的焦點，因此使它們成為藥物發現的有吸引力的目標。然而，近年來，隨著修飾的非編碼 RNA（microRNA、lincRNA等）已成為細胞過程和疾病進展的關鍵參與者，RNA 修飾的作用獲得了很大的發展。在所有RNA種類中，修飾最多的是rRNA和tRNA，迄今為止已鑒定出 170 多種此類修飾。識別 RNA 修飾的傳統方法是色譜技術和質譜法，由于化學方法的進步與高通量測序相結合，新發現了更多的修飾。然而，由于靈敏度和準確識別這些修飾的技術有限，新興的 RNA 表觀轉錄組學領域仍然難以探索。主要是考慮到區分它們相似的化學結構的挑戰。鑒于此，南京大學黃碩等人報告了一種基于納米孔的策略，可以高分辨率檢測 RNA 的修飾。使用這種方法，作者能夠用他們的自定義堿基調用者區分 11 種不同的修飾的單磷酸核苷(NMP)，準確率達到 99.6%。成果發表在Nature Nanotechnology上。生物納米孔為單分子的可調諧傳感和實時檢測提供了一個平臺。在這項概念驗證研究中，研究人員報告了一種smegmatis分枝桿菌孔蛋白A (MspA) 蛋白的設計，他們在其中設計了一個窄孔收縮中的單個半胱氨酸。然后，單個半胱氨酸殘基充當苯硼酸 (PBA) 的適配器，苯硼酸 (PBA) 是一種可以與順式二醇共價反應的化合物，因此充當與NMP核糖中存在的順式二醇反應的有效傳感器。單通道電流記錄顯示，在添加PBA后，與開放通道電流相比，電流下降約100 pA。這表明PBA與半胱氨酸結合，從而占據了孔隙。作者首先測試了是否可以使用該MspA-PBA系統分別檢測這四種典型核苷酸。當向納米孔連續施加200 mV偏壓時，觀察到測試的 NMP 的代表性電流脈沖，同時檢測所有四種核苷酸（AMP、CMP、UMP、GMP）對每種 NMP 產生不同的電流阻斷事件。圖|使用 PBA 修飾的 MspA 區分典型NMP除了在 mRNA 上發現的最豐富的N6-甲基腺苷 (M6A) 修飾外，其他一些相關的 RNA 修飾包括 5-甲基胞嘧啶 (m5C)、7-甲基鳥苷 (m7G)、N1-甲基腺苷 (m1A)、假尿苷 (Ψ)、肌苷 (I) 和二氫尿嘧啶 (D)。作者接下來測試了其中的七種表觀遺傳 RNA 修飾化合物（m5C、m6A、m7G、m1A、I、Ψ 和 D）以及四種典型的 NMP。納米孔電流阻斷事件顯示出所有11種NMP 之間的明顯差異，除了 UMP 和 m5C，它們顯示出一些重疊。然而，為了進一步區分所有群體，將噪聲（作為標準偏差）與阻塞水平百分比作圖會導致所有部分的完全分辨率。這表明 MspA-PBA系統在能夠區分所有11種類型的NMP測試和區分規范對應物之間的結構差異方面的敏感性。主要挑戰是準確檢測和識別修改中的細微差異。作者構建了一個自定義機器學習算法，該算法使用為每個 NMP 生成的代表性數據事件，并使用該數據集訓練機器學習算法。分類器算法能夠以接近 100% 的準確率區分每個 NMP 部分。這種MspA-PBA系統與機器學習算法相結合的可行性已通過檢測天然存在的 RNA（如 microRNA 和 tRNA）進行測試，眾所周知，tRNA具有最復雜的修飾之一。在單獨的實驗中，這些RNA首先被酶降解，然后添加到納米孔的順式側。從每個RNA子集的原始事件中獲得的NMP組成與實際序列一致，表明每種類型的事件都可以通過算法識別和量化。這種基于納米孔的 PBA 傳感器可以作為基于核酸外切酶的測序的起點，其中切割的核苷酸可以依次送入納米孔傳感器進行檢測。這種傳感器與直接 RNA 測序方法（例如 Oxford Nanopore Technologies 測序方法）相結合，可以實現 RNA 的全長外轉錄組分析。這種MspA-PBA系統為基于納米孔的表觀遺傳RNA修飾測序提供了一種有前途的方法。盡管如此，在使用該系統時，有幾件事需要牢記：1）文庫制備可能需要額外的純化步驟來去除混合物中存在的某些試劑，這些試劑可能會在電生理記錄過程中產生噪音。2）從生物樣品中提取RNA，例如從組織中提取微RNA，由于其豐度低而困難。3）此外，隨著識別出更新類型的修改，將需要對算法進行進一步的模型訓練。Wang, Y., Zhang, S., Jia, W. et al. Identification of nucleoside monophosphates and their epigenetic modifications using an engineered nanopore. Nat. Nanotechnol. (2022).https://doi.org/10.1038/s41565-022-01169-2
