血腦屏障（BBB）是基因傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的一個(gè)巨大障礙。事實(shí)上，一些血清型的腺相關(guān)病毒（AAV），包括臨床證實(shí)的AAV9，即使大劑量給藥也無(wú)法克服BBB。在小鼠模型中，設(shè)計(jì)更有效地跨越BBB的AAV載體(即，中樞神經(jīng)嗜性AAV載體)的努力通常是卓有成效的。然而，將這些工程化的AAV載體從嚙齒動(dòng)物轉(zhuǎn)化為大型動(dòng)物一直是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中設(shè)計(jì)一種比AAV9（“黃金標(biāo)準(zhǔn)”AAV載體）效率高出五到十倍的嗜中樞神經(jīng)系統(tǒng)AAV載體，可以極大地促進(jìn)為廣泛的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病開(kāi)發(fā)的基因治療。
成果簡(jiǎn)介
鑒于此，哈佛醫(yī)學(xué)院Fengfeng Bei等研究人員利用AAV9作為親本載體，構(gòu)建一種AVV載體，提高其在小鼠和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)穿透BBB的效率，并為其臨床轉(zhuǎn)化適用性提供概念證明。
轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高6倍
作為正在進(jìn)行的篩選工作的一部分，研究人員在AAV9衣殼中常用的588/589位點(diǎn)基因插入了14個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞穿透肽（CPP），并篩選了這些AVV變異體穿透BBB的能力。進(jìn)一步測(cè)試了另外七種CPP樣肽，以優(yōu)化第一輪篩選中的最佳CPP候選肽。分別產(chǎn)生AAV候選病毒，并將其靜脈注射到小鼠和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物（特別是食蟹猴）體內(nèi)，以評(píng)估其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖|小鼠血腦屏障穿透性AAV變異體衣殼工程研究
該課題組鑒定了兩種肽插入物（AAV.CPP.16中的TVSALK和AAV.CPP.21中的TWSALFK），它們?cè)诙鄠€(gè)小鼠品系中可以將AAV9衣殼的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高了6倍以上。重要的是，AAV.CPP.16的神經(jīng)趨向性從小鼠轉(zhuǎn)移到食蟹猴身上。AAV.CPP.16比AAV9在動(dòng)物模型中的這種增強(qiáng)作用與作者的發(fā)現(xiàn)是一致的，即AAV.CPP.16與AAV9相比，在人類BBB的體外模型中顯示出更多的穿胞作用，并在培養(yǎng)的人類細(xì)胞系中增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖|AAV.CPP.16對(duì)血腦屏障完整性、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
可靜脈遞送抗體和酶
此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)AAV.CPP.16可用于在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的小鼠模型中靜脈遞送抗程序性死亡配體1抗體（αPD-L1）或單純皰疹病毒1型胸苷激酶（一種 "自殺 "基因，與前體藥物結(jié)合后可殺死腫瘤細(xì)胞）。盡管AAV.CPP.16只轉(zhuǎn)導(dǎo)了一小部分腫瘤細(xì)胞（大約10%），但這兩種治療方法都產(chǎn)生了驚人的促進(jìn)生存的益處。
圖|AAV.CPP.16為基礎(chǔ)的系統(tǒng)性PD-L1抗體治療
總結(jié)與展望
AAV.CPP.16是向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送治療性轉(zhuǎn)基因的很有希望的載體，特別是對(duì)于具有彌漫性病理和明確遺傳病因的疾病。要考慮的疾病目標(biāo)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在這些疾病中，可以應(yīng)用細(xì)胞之間的“交叉糾正”，例如通過(guò)分泌蛋白質(zhì)。鑒于AAV.CPP.16對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或浦肯野細(xì)胞的高度趨向性，主要影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或浦肯野細(xì)胞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病也可以成為靶點(diǎn)，而且使用AAV.CPP.16通過(guò)BBB傳遞抗體來(lái)治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是可能的。事實(shí)上，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，血腦屏障只被部分破壞，而對(duì)于這種癌癥，血腦屏障藥物輸送有限是其他有希望的治療失敗的主要原因。
該研究的一個(gè)局限性是，研究人員沒(méi)有系統(tǒng)地評(píng)估AAV.CPP.16在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。研究人員使用的報(bào)告基因和或免疫組織學(xué)方法在允許轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的可視化方面是不理想的。由于技術(shù)原因，也沒(méi)有在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行病毒基因組的生物分布。該研究的另一個(gè)注意事項(xiàng)是，當(dāng)AAV.CPP.16在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中制備時(shí)，會(huì)在高濃度下觀察到病毒顆粒的聚集。盡管現(xiàn)在有證據(jù)表明，這種聚集是由AAV.CPP.16制劑中的雜質(zhì)引起的，但目前還不清楚這種問(wèn)題是否以及如何影響本研究中AAV.CPP.16的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
下一步，研究人員希望使用綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，系統(tǒng)地評(píng)估高度純化的AAV.CPP.16載體在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平的生物分布。該研究的結(jié)果將進(jìn)一步驗(yàn)證AAV.CPP.16作為基因治療載體的應(yīng)用。對(duì)AAV.CPP.16的外殼進(jìn)行工程設(shè)計(jì)以進(jìn)一步提高其在全身給藥后對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異性也將是有意義的。
參考文獻(xiàn)：
Yao, Y., Wang, J., Liu, Y. et al. Variants of the adeno-associated virus serotype 9 with enhanced penetration of the blood–brain barrier in rodents and primates. Nat. Biomed. Eng (2022).
https://doi.org/10.1038/s41551-022-00938-7
