三維 (3D) 培養(yǎng)中的干細胞可以自我組織成復雜的多細胞結(jié)構(gòu)，稱為類器官，類似于它們所源自的器官的解剖和功能單位。通過提供一種在傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)方便的情況下概括體內(nèi)生理系統(tǒng)復雜性的方法，類器官已成為研究生物醫(yī)學應用中各種器官的發(fā)育、健康和疾病的有利研究平臺。在傳統(tǒng)的實驗室環(huán)境中，形成類器官的最常見方法是將多能干細胞或成體干細胞嵌入細胞外基質(zhì) (ECM) 水凝膠（如 Matrigel）的液滴中。當提供含有特定可溶性因子的培養(yǎng)基時，3D 環(huán)境會誘導分化細胞分離成不同的區(qū)域并進行命運規(guī)范，從而導致它們自發(fā)組織成器官樣結(jié)構(gòu)。
這種傳統(tǒng)方法中的類器官形成過程依賴于被動擴散來提供養(yǎng)分和去除廢物。然而，隨著類器官的繼續(xù)生長和對代謝的要求越來越高，營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣向 3D 支架內(nèi)部區(qū)域的有限擴散導致形成壞死核心，細胞活力大大降低，最終通過整個水凝膠結(jié)構(gòu)傳播。這種退化過程發(fā)生的速度取決于類器官的類型及其生長速度。例如，在腸道類器官的情況下，大量的細胞死亡在 10 天內(nèi)變得明顯。在現(xiàn)有的培養(yǎng)方案中，通過每 5-7 天傳代類器官來防止這個問題，但每個培養(yǎng)周期的這種短暫持續(xù)時間被認為是一個關(guān)鍵問題，因為它對建立長期不間斷、連續(xù)的類器官培養(yǎng)提出了根本性挑戰(zhàn)，這是它們持續(xù)成長和成熟所必需的。
為了應對這一挑戰(zhàn)，研究人員使用生物反應器來改善擴散運輸并建立類器官的長期培養(yǎng)，以促進它們在體外的持續(xù)發(fā)展。然而，在常規(guī)實驗室環(huán)境中實施這種技術(shù)需要昂貴的資本設(shè)備，這些設(shè)備機械復雜，需要專門的操作和維護知識。雖然已建議將類器官的血管化作為一種替代策略，但生成具有受控血管灌注的類器官模型的過程非常復雜，并且通常需要先進的培養(yǎng)系統(tǒng)和專門的體外技術(shù)，而這些技術(shù)對于非工程師來說是不容易獲得的。
成果簡介
鑒于此，賓夕法尼亞大學Dan Dongeun Huh等人提出了一種令人興奮且有前途的策略來培養(yǎng)具有增強細胞多樣性和功能的腸道和其他類器官。他們開發(fā)了一個簡單、可立即部署的模塊化平臺（OCTOPUS，Organoid Culture-based Three-dimensional Organogenesis Platform with Unrestricted Supply of Soluble Signals），可以緩解營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的均勻擴散，從而生長出更大、更好和更復雜的類器官。
制備簡單！
該系統(tǒng)被制造為簡單的培養(yǎng)插件，可以在標準細胞培養(yǎng)板中使用，無需對已建立的協(xié)議和工作流程進行任何修改。從本質(zhì)上講，該方法可以概念化為（1）從水凝膠液滴中去除壞死核心，同時保持外層含有可行的類器官；（2）徑向分割剩余層并將其展開以形成類器官的平面陣列。通過減少培養(yǎng)支架的厚度，該陣列旨在允許營養(yǎng)、氧氣和其他可溶性因子不受限制地快速擴散和補充。
圖|類器官培養(yǎng)
為了實現(xiàn)這個想法，研究人員創(chuàng)建了一個圓盤形設(shè)備，可以在標準細胞培養(yǎng)板中生產(chǎn)徑向排列的類器官陣列。OCTOPUS由八個相同的培養(yǎng)室組成，其橫截面尺寸為 1?mm×?1?mm。重要的是，培養(yǎng)室對外部環(huán)境開放，并包含從開口邊緣突出的微小臺階。在這個系統(tǒng)中建立了類器官培養(yǎng)只需要兩個簡單的步驟。
1）首先，懸浮在水凝膠前體中的干細胞通過入口移液到中央室，并均勻地分布到培養(yǎng)室中。在此過程中，表面張力的作用是將液體彎月面固定在臺階上，從而使注入的溶液前進并充滿整個腔室，而不會通過開口溢出。
2）凝膠化后，將培養(yǎng)基添加到包含裝置的孔中，以通過暴露的水凝膠表面為嵌入的細胞提供營養(yǎng)供應 OCTOPUS 設(shè)計為可移動的培養(yǎng)插入物，使該系統(tǒng)易于轉(zhuǎn)移，便于處理和分析培養(yǎng)的類器官。
格式可定制
另外，也可以很容易地改變培養(yǎng)室的數(shù)量、大小和形狀，這提供了一種控制在該系統(tǒng)中生成的含有類器官的組織結(jié)構(gòu)的體積和空間組織的方法。同樣，OCTOPUS 的設(shè)計可以通過在同一設(shè)備上創(chuàng)建可單獨訪問的培養(yǎng)室來修改以生長兩種或多種類型的類器官。此外，OCTOPUS 的整體尺寸和形狀可以根據(jù)標準培養(yǎng)板的不同孔尺寸和格式進行定制，為可擴展的類器官生產(chǎn)和實驗提供機會。
圖|使用 OCTOPUS 進行常規(guī)類器官培養(yǎng)的幾何工程
培養(yǎng)時間長達3周！
研究人員展示了使用小鼠成體干細胞衍生的腸道類器官可以延長腸道類器官的維持時間并提高其成熟度。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法（包括液滴和單層）相比，體外培養(yǎng)產(chǎn)生了長期可行的類器官和更快的生長。OCTOPUS 允許腸道類器官的長期發(fā)育長達 3 周，無需傳代，而在傳統(tǒng)培養(yǎng)中可以達到 5-7 天。與基于液滴的培養(yǎng)物相比，在OCTOPUS培養(yǎng)物中可以觀察到具有增加的隱窩樣結(jié)構(gòu)域長度的恒定出芽，并且與增殖細胞（包括 LGR5+ 細胞）的活性增加有關(guān)。這些增殖性上皮細胞在培養(yǎng) 14 天后在隱窩樣結(jié)構(gòu)域的底部自組織。有組織的隱窩絨毛樣軸的形成也與分化標志物表達所描繪的細胞多樣性增加有關(guān)。
圖|長期培養(yǎng)對OCTOPUS腸道類器官成熟的影響
圖|OCTOPUS 人類腸道類器官的長期培養(yǎng)
值得注意的是，觀察到調(diào)節(jié)腸道屏障功能的上皮轉(zhuǎn)運蛋白的表達更加穩(wěn)健，例如肽轉(zhuǎn)運蛋白 1 (PEPT1) 或鈉-葡萄糖連接的轉(zhuǎn)運蛋白 1 (SGLT1)。增加的 ATP 活性和更高濃度的葡萄糖誘導的胰高血糖素樣肽 1 (GLP-1) 和粘蛋白-2 (MUC2) 分泌的釋放進一步證明了類器官功能成熟度的提高。因此，長期的類器官培養(yǎng)使作者能夠捕捉到傳統(tǒng) ECM 液滴培養(yǎng)中未見的事件。
模型更加成熟
在 ECM 液滴培養(yǎng)中不太可能觀察到人類腸道類器官隨時間的自發(fā)和穩(wěn)健分化。為了指導上皮細胞的命運，有必要改變培養(yǎng)基的組成，包括 WNT 和其他信號通路。于此，使用 OCTOPUS，人類腸道類器官可以成功生長一個多月，而無需傳代或培養(yǎng)基配方變化。單細胞 RNA 測序?qū)嶒炞C實，隨著腸上皮細胞向成熟腸細胞分化，細胞多樣性增加。此外，發(fā)現(xiàn)更多的腸干細胞在隱窩樣結(jié)構(gòu)域的底部具有生理定位。研究結(jié)果顯示，與類器官相比，OCTOPUS 培養(yǎng)物中促進人類腸上皮細胞分化的生長因子分泌更多，例如胰島素樣生長因子1 (IGF-1) 和成纖維細胞生長因子 2 (FGF-2)在ECM 液滴中。這些發(fā)現(xiàn)得到了先前研究的支持，該研究表明補充 IGF-1 和 FGF-2 的培養(yǎng)基可以增強上皮分化并增加細胞群異質(zhì)性。
圖|OCTOPUS 中人類小腸的 scRNA-seq
最后，該平臺的優(yōu)勢和多功能性通過對患者特異性炎癥性腸病 (IBD) 進行建模來體現(xiàn)。研究人員通過添加包含來自 IBD 患者的內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和腸道類器官的細胞微環(huán)境來構(gòu)建設(shè)備的復雜性。由此產(chǎn)生的系統(tǒng)顯示出比單獨生長的人類腸道類器官更持久和穩(wěn)健的 IBD 表型。
圖|OCTOPUS中基于類器官的人類 IBD 模型
圖|OCTOPUS-EVO 中血管化人小腸的微工程
小結(jié)
綜上所述，該研究提出了一個簡單、靈活和可自動化的平臺，可以在該平臺上長時間同時生長組織特異性類器官或多種類器官類型。這個新平臺可以提高我們培養(yǎng)類器官的能力，并幫助我們了解在體外設(shè)計更好的器官所需的環(huán)境參數(shù)。ECM 隔室的幾何工程至關(guān)重要，并且對于使類器官更接近生理現(xiàn)實是必要的。OCTOPUS的未來迭代可能會解決進入管腔的問題。對于生物學家和工程師來說，這是一個激動人心的時刻，因為在我們學科的十字路口，我們可以以最可靠的方式共同實現(xiàn)類器官，甚至可能是器官工程。
參考文獻：
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