2022年的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Dr. Sharpless和Dr. Meldal大約在20年前開(kāi)發(fā)的疊氮化物和炔烴之間的銅催化反應(yīng)由于其簡(jiǎn)單高效的“品質(zhì)”被譽(yù)為點(diǎn)擊反應(yīng)“皇冠上的明珠”，并已成為藥物研發(fā)以及生物醫(yī)用等領(lǐng)域極具吸引力的合成路徑之一。而近年來(lái)，納米孔作為一個(gè)單分子檢測(cè)技術(shù)，由于其極高的空間分辨率與較為直觀的檢測(cè)原理，已經(jīng)形成一個(gè)體系較為完整且功能獨(dú)特的單分子生物傳感手段。目前納米孔單分子技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于基因測(cè)序，蛋白檢測(cè)以及分子識(shí)別等諸多領(lǐng)域。
不同領(lǐng)域的交叉和融合總能帶來(lái)驚喜。近日，美國(guó)南卡羅來(lái)納大學(xué)的生物傳感和生物標(biāo)志物研究小組就巧妙的將點(diǎn)擊化學(xué)和納米孔技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了一種“CAN”檢測(cè)方法（Click Chemistry Amplified Nanopore Assay）: 點(diǎn)擊化學(xué)將HIV 抗原p24信號(hào)放大并轉(zhuǎn)化為DNA信號(hào)，并通過(guò)納米孔實(shí)現(xiàn)了該生物標(biāo)志物的靈敏檢測(cè)和定量分析，臨床樣本的概念性驗(yàn)證結(jié)果表明了該策略在HIV檢測(cè)中的發(fā)展和應(yīng)用潛力。相關(guān)成果以“A click chemistry amplified nanoporeassay for ultrasensitive quantification of HIV-1 p24 antigen in clinicalsamples”為題近期發(fā)表在Nature Communications 雜志。
研究人員首先用捕獲抗體修飾的磁珠將p24抗原從人血清中分離出來(lái)，接著利用連接CuO納米顆粒的檢測(cè)抗體與以上分離物形成三明治結(jié)構(gòu)，建立了抗原和CuO顆粒的對(duì)應(yīng)關(guān)系；隨后通過(guò)酸處理將該結(jié)構(gòu)上的CuO溶解釋放出Cu離子; 隨后用富集的Cu離子催化疊氮金剛烷（1-Azidoadamantane, AA）和炔基修飾的單鏈DNA發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)形成更容易通過(guò)納米孔的DNA-AA結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了p24抗原信號(hào)到DNA-AA信號(hào)的轉(zhuǎn)化。
CAN 策略的工作示意圖
為了提高用于量化抗原的DNA-AA結(jié)構(gòu)通過(guò)納米孔時(shí)的特異性, 研究人員借鑒了金剛烷和瓜環(huán)（CB[6]）的主客體效應(yīng)，最終構(gòu)建了DNA-AA@CB[6]探針，賦予了該結(jié)構(gòu)穿過(guò)納米孔時(shí)的特異性信號(hào)—振蕩信號(hào)。形象地說(shuō)，如果把納米孔比作一個(gè)T臺(tái)秀場(chǎng)，DNA-AA@CB[6]結(jié)構(gòu)的每次出場(chǎng)都會(huì)擺出自己專屬的“pose”. 這些特異性信號(hào)極大程度的簡(jiǎn)化了納米孔電流阻塞信號(hào)的處理，提高了檢測(cè)的特異性。
研究人員進(jìn)一步在三明治結(jié)構(gòu)中引入生物素和親和素，實(shí)現(xiàn)了從抗原信號(hào)到CuO顆粒信號(hào)的二次放大；在借助質(zhì)譜深度解析Cu離子與DNA-AA的正相關(guān)關(guān)系后，最終通過(guò)α-溶血素生物納米孔(α-HL）建立了抗原與DNA-AA@CB[6]特征信號(hào)頻率之間的線性關(guān)系。在對(duì)人血清中p24的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，該方法的最終檢測(cè)限能達(dá)到0.5pg/mL.
研究人員將研發(fā)出的“CAN”策略分別與臨床用的第四代HIV檢測(cè)試劑盒（ELISA）以及基于Cu發(fā)光團(tuán)簇的檢測(cè)方法進(jìn)行了肩比肩試驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果顯示“CAN”策略的靈敏度高于對(duì)比方法多達(dá)20-100倍。最后，該方法被進(jìn)一步應(yīng)用于118個(gè)艾滋病相關(guān)的臨床樣本檢測(cè)中，并得到了與其它臨床HIV標(biāo)志物發(fā)展相似的趨勢(shì)，且在低濃度p24樣本中展示出了相比ELISA的明顯優(yōu)勢(shì), 其靈敏度達(dá)到了87.3%, 而ELISA檢測(cè)靈敏度僅為18.2%。
CAN 策略與ELISA在118個(gè)臨床樣本中的對(duì)比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
隨著科學(xué)的不斷創(chuàng)新和進(jìn)步，醫(yī)療體系中已經(jīng)發(fā)展出了很多應(yīng)對(duì)和治療HIV的方法, 但進(jìn)展仍舊緩慢。報(bào)告顯示，僅在2021年，全球就有65萬(wàn)人死于艾滋病。按照目前的發(fā)展趨勢(shì)，到2025年每年的新增感染人數(shù)將超過(guò)120萬(wàn)。因此HIV早期感染的檢測(cè)以及預(yù)后的監(jiān)測(cè)尤為重要。“CAN”策略的發(fā)展無(wú)疑為推動(dòng)HIV的早期檢測(cè)以及其它疾病標(biāo)志物的檢測(cè)提供了新的思路。值得一提的是, 前人栽樹，后人乘涼，來(lái)自中科院化學(xué)研究所的吳海臣研究員團(tuán)隊(duì)在點(diǎn)擊化學(xué)與納米孔結(jié)合檢測(cè)標(biāo)志物的方向上的早期工作為本研究中“CAN”體系的建立和優(yōu)化奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前該聯(lián)盟策略已經(jīng)被嘗試應(yīng)用于多種疾病標(biāo)志物的檢測(cè)和研究中。然而, 如何將該技術(shù)推動(dòng)到現(xiàn)實(shí)世界的應(yīng)用中，研究人員還有很長(zhǎng)的路需要探索。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34273-x
研究小組簡(jiǎn)介：位于美國(guó)南卡羅萊納大學(xué)的生物傳感和生物標(biāo)志物研究小組由劉暢教授主導(dǎo)，致力于發(fā)展與納米材料、納米孔、微流控、生物傳感與器件、分析化學(xué)、單分子檢測(cè)等領(lǐng)域相關(guān)的生物工程技術(shù).以上工作主要由衛(wèi)小軍博士主導(dǎo)完成。目前課題組全面開(kāi)放博士后以及全獎(jiǎng)博士生等職位。歡迎相關(guān)領(lǐng)域的同學(xué)加入。
詳情請(qǐng)見(jiàn)：https://www.biosensingandbiomarker.com/
