近三十年來(lái)，熒光蛋白 (FP) 一直被用于探測(cè)細(xì)胞生物學(xué)，但傳統(tǒng)的熒光蛋白 (FP) 不適合現(xiàn)代組織處理和固定樣品的超分辨率 (SR) 顯微鏡的實(shí)驗(yàn)條件。即使是通過(guò)多聚甲醛對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行常規(guī)固定也會(huì)減少FP信號(hào)，并且保存條件（例如組織透明化，一種通過(guò)最小化其散射和吸收的光來(lái)使樣品透明的技術(shù)）比FP進(jìn)化和設(shè)計(jì)的條件更苛刻。光電關(guān)聯(lián)顯微鏡 (CLEM) 是一種超分辨率技術(shù)，需要使用四氧化鋨 (OsO4)制備樣品，這是一種強(qiáng)大的固定劑，可以保留超微結(jié)構(gòu)，但會(huì)使蛋白質(zhì)變性。盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)出對(duì) OsO4 具有更高耐受性的 FP，但仍然存在固定劑耐受性 FP 選項(xiàng)稀缺且探索不足。類(lèi)似地，大多數(shù)蛋白質(zhì)在鹽酸胍 (GdnHCl) 溶液中迅速變性，鹽酸胍是一種離液劑（一種在水溶液中破壞水分子之間氫鍵的分子），通常用于溶解和重新折疊錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)?？梢猿惺軡饪s GdnHCl 的 FP 將促進(jìn)明亮發(fā)光的色譜純化，而不是不可見(jiàn)的未折疊蛋白質(zhì)，并可能為組織學(xué)開(kāi)辟新的選擇。先前，加州大學(xué)Benjamin C. Campbell等人根據(jù)報(bào)道和假設(shè)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，通過(guò)突變來(lái)自Aequorea victoria水母的 FP，設(shè)計(jì)了一種亮綠色 FP，mGreenLantern (mGL)，這增強(qiáng)了它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的溶解度、穩(wěn)定性和表達(dá)水平。研究人員認(rèn)為mGL在蛋白質(zhì)保留擴(kuò)展顯微鏡（proExM，一種使用衍射極限顯微鏡對(duì)通過(guò)化學(xué)過(guò)程物理放大的保存標(biāo)本進(jìn)行納米級(jí)成像的技術(shù)）和組織清除中的良好性能是由于其高熔化溫度和抗化學(xué)變性（例如，通過(guò)GdnHCl），因此，研究人員篩選了大型基于mGL的庫(kù)，以尋找具有改進(jìn)的化學(xué)和熱穩(wěn)定性的變體。于此，該課題組篩選出了一種非常穩(wěn)定的黃色熒光蛋白（YFP），即“超折疊YFP”（hfYFP）的合理工程，該蛋白能夠承受在數(shù)秒內(nèi)變性大多數(shù)生物結(jié)構(gòu)的離液條件，包括超折疊綠色熒光蛋白（GFP）。最強(qiáng)大的突變體“超折疊”黃色熒光蛋白在靶向細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)定位正確，而且，它在7 M GdnHCl中保持熒光數(shù)月，而增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）甚至超折疊GFP（sfGFP）在同一溶液中則立即變性。hfYFP耐受OsO4和CLEM的脫水和塑膠樹(shù)脂包埋步驟。使用hfYFP，研究人員使用臺(tái)式LED條可視化了常規(guī)的通過(guò)親和層析變性蛋白質(zhì)純化的所有步驟，使分離蛋白質(zhì)組分和監(jiān)測(cè)蛋白水解切割變得更加容易。圖|hfYFP的生化特性及其在細(xì)胞中的作用在本研究中產(chǎn)生的晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，研究人員突變了hfYFP并生成了具有高化學(xué)穩(wěn)定性的 405 nm可激發(fā)的GFP：大斯托克斯位移單體 GFP (LSSmGFP)。它具有與mT藍(lán)寶石相同的光穩(wěn)定性，并且由于LSSmGFP中不存在mT藍(lán)寶石中存在的殘余488nm激發(fā)帶，因此消除了用GFP進(jìn)行多色成像期間的熒光滲漏。圖|LSS-GFP的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向工程及其在熒光輔助蛋白純化中的應(yīng)用hfYFP比 sfGFP 穩(wěn)定得多，并且由于sfGFP支架和突變對(duì)許多生物傳感器、效應(yīng)器和其他分子工具都有貢獻(xiàn)，研究人員設(shè)想 hfYFP、其單體變體 mhYFP 和mGL 變體 FOLD6 —具有高分辨率晶體結(jié)構(gòu)（分別為1.7?、1.6?和1.2?）—成為創(chuàng)建和改進(jìn)下一代生物傳感器和其他工具的有用模板。當(dāng)使用eGFP或sfGFP僅產(chǎn)生非熒光、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)時(shí)，研究人員已經(jīng)使用 hfYFP 開(kāi)發(fā)了高度響應(yīng)的小分子和還原和氧化電位生物傳感器。該hfYFP 是一個(gè)“超折疊”原型。hfYFP 與 proExM 兼容，但mGL 的穩(wěn)定性和高亮度的結(jié)合仍然使其成為這種模式的更好選擇。相比之下，hfYFP 是 CLEM 的更好選擇，因?yàn)樗梢猿惺?OsO4。hfYFP 的最大限制可能是其在激光掃描共聚焦照明下的光穩(wěn)定性相對(duì)較低：它比 eGFP 和Clover（GFP 變體）漂白（失去熒光）更快。最后，hfYFP的耐久性可能使其在細(xì)胞中積累并抵抗蛋白水解降解；因此，高穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)取決于應(yīng)用。從超折疊晶體結(jié)構(gòu)中可以學(xué)到很多東西。生物物理實(shí)驗(yàn)可以揭示hfYFP在其他FP被破壞時(shí)抵抗GdnHCl和熱量的機(jī)制，這一發(fā)現(xiàn)可能有助于蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性的基礎(chǔ)知識(shí)。
我們期待看到化學(xué)穩(wěn)定的 FP 可以在整個(gè)生物科學(xué)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮什么作用！
參考文獻(xiàn)：
Campbell, B.C., Paez-Segala, M.G., Looger, L.L. et al. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods (2022).
https://doi.org/10.1038/s41592-022-01660-7
