記錄歷史，可以讓我們以史為鑒，借古論今。一開始人們利用結(jié)繩記事，再到后面的象形字，甲骨文，史書等等，正是由于這些歷史記錄不斷進(jìn)化，我們的璀璨的文明才得以傳流至今。如今，科學(xué)家們還想要記錄我們體內(nèi)細(xì)胞的生命史，以幫助我們了解更豐富的生命活動(dòng)。
近日，Nature Biotechnology雜志中的兩項(xiàng)研究描述了在尋找追蹤單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性歷史的技術(shù)方面的突破。
目前在高時(shí)空分辨率下探測(cè)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的方法具有顯著的局限性。由于顯微鏡的物理限制，使用熒光報(bào)告器對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行光學(xué)成像僅限于少量細(xì)胞。固定組織中的成像克服了這些空間限制，但不能提供細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)隨時(shí)間的連續(xù)記錄。該兩項(xiàng)研究的新方法結(jié)合了兩種方法的優(yōu)點(diǎn)。研究人員使用以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的纖維，以穩(wěn)定的速度生長(zhǎng)，使用染料或熒光蛋白在單細(xì)胞中“寫入”轉(zhuǎn)錄事件，然后對(duì)蛋白質(zhì)纖維進(jìn)行光學(xué)讀取，以重建事件的歷史。以這種方式跟蹤細(xì)胞歷史的能力將有助于研究正?；虿±磉^程中涉及的關(guān)鍵事件的時(shí)間。
圖|記錄轉(zhuǎn)錄活性的分子系統(tǒng)
先前的研究已經(jīng)證明了以核酸形式編碼細(xì)胞歷史的可行性。然而，DNA或RNA序列修飾的分析需要細(xì)胞裂解，這消除了空間信息。相比之下，這兩項(xiàng)研究的基于蛋白質(zhì)的方法保留了空間信息，使得能夠在完整組織的背景下繪制復(fù)雜細(xì)胞群體的活動(dòng)圖。
第一篇研究Lin等人的方法是一種基于自然結(jié)晶現(xiàn)象的錄音帶（ticker tapes）系統(tǒng)。當(dāng)融合蛋白iPAK4（由絲氨酸/蘇氨酸激酶PAK4的催化結(jié)構(gòu)域和其內(nèi)源性抑制劑iBox的33個(gè)殘基組成）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它在細(xì)胞質(zhì)中形成桿狀蛋白晶體。該晶體有一個(gè)中央通道，其大小足以容納其他蛋白質(zhì)，如EGFP或HaloTag（HT）。作者首次表明，細(xì)胞中EGFP–iPAK4和HT–iPAK5的表達(dá)導(dǎo)致HT和EGFP結(jié)合到生長(zhǎng)的晶體纖維中。
通過添加用戶選擇的HT配體染料來實(shí)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞中時(shí)間戳的精確顏色劃分。當(dāng)表達(dá)時(shí)，與HT融合的目的蛋白將與染料結(jié)合并結(jié)合到生長(zhǎng)的晶體中。由于纖維在一次染料注射和下一次注射之間以近似恒定的速率生長(zhǎng)，因此在該時(shí)間間隔內(nèi)在纖維上留下標(biāo)記的任何轉(zhuǎn)錄活性的時(shí)間可以從已知的染料注射時(shí)間推斷。在細(xì)胞間纖維長(zhǎng)度和生長(zhǎng)率不均勻的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，這一特性對(duì)于插值細(xì)胞事件的精確定時(shí)非常重要。固定后，可以分析顏色的位置(染料和轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)的熒光標(biāo)記蛋白)。細(xì)胞間的差異可以通過單個(gè)細(xì)胞中晶體生長(zhǎng)速率的標(biāo)準(zhǔn)化來校正。
正如Lin等人所證明的，該技術(shù)能夠以5–10分鐘的時(shí)間分辨率實(shí)現(xiàn)光纖生長(zhǎng)的廣域延時(shí)成像。但這種高時(shí)間分辨率伴隨著記錄持續(xù)時(shí)間的權(quán)衡。由于iPAK4晶體不能在細(xì)胞中無限生長(zhǎng)，成像時(shí)間在纖維成核后約10–24小時(shí)。最大記錄持續(xù)時(shí)間可能取決于其環(huán)境，需要進(jìn)一步調(diào)查。這種方法有可能在一個(gè)小的大腦中實(shí)現(xiàn)活動(dòng)映射。事實(shí)上，作者證明了在結(jié)合c-Fos誘導(dǎo)的EGFP蛋白報(bào)告子和四環(huán)素介導(dǎo)的Tet-ON轉(zhuǎn)錄的系統(tǒng)中，單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中啟動(dòng)子活性的定量。
圖|iPAK4形成細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維
在第二項(xiàng)研究中，Linghu等人描述了一種稱為表達(dá)記錄島（expression recording islands, XRI）的轉(zhuǎn)錄活性跟蹤系統(tǒng)，該系統(tǒng)依賴于自組裝蛋白鏈和熒光成像。它在概念上類似于Lin等人的錄音帶系統(tǒng)，但它是完全基因編碼的，因此不需要注射染料。XRI系統(tǒng)使用八聚體同聚體1POK(E239Y)的突變形式，這是一種基于大腸桿菌異氨酰二肽酶的工程化成絲蛋白。作者通過將1POK(E239Y)融合到“絕緣體”成分(如mEGFP或麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP標(biāo)簽))上來制造其他變體，以確保蛋白組裝僅產(chǎn)生纖維樣結(jié)構(gòu)，而非蛋白聚集體。
由于蛋白質(zhì)鏈以恒定的速率連續(xù)生長(zhǎng)，較高濃度的蛋白質(zhì)單體更有可能結(jié)合到鏈中。因此，當(dāng)具有一個(gè)表位標(biāo)簽的蛋白質(zhì)單體正在形成鏈時(shí)，如果具有不同表位標(biāo)簽的其它蛋白質(zhì)單體由活性依賴性啟動(dòng)子表達(dá)，則每個(gè)表位標(biāo)簽的水平可以通過事后免疫染色來定量。
為了了解這個(gè)系統(tǒng)的能力，確定蛋白質(zhì)組裝的時(shí)間限制和可以測(cè)量的最長(zhǎng)時(shí)間段是很重要的。這些參數(shù)取決于細(xì)胞狀態(tài)和所給予的刺激類型。作者證明，在活神經(jīng)元中，蛋白質(zhì)組裝的延長(zhǎng)率在7天內(nèi)保持一致。時(shí)間校準(zhǔn)與細(xì)胞群中XRI的長(zhǎng)度、厚度或曲率無關(guān)，也不取決于XRI上攜帶信息的標(biāo)簽（例如Flag標(biāo)簽）的類型。由于XRI是基因編碼的，并允許活細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)，因此作者能夠在清醒的小鼠中記錄類似的時(shí)間信息，并在同一細(xì)胞中發(fā)生兩個(gè)不同的連續(xù)轉(zhuǎn)錄事件。這種較長(zhǎng)的記錄持續(xù)時(shí)間的代價(jià)是較低的時(shí)間精度。時(shí)間分辨率似乎需要幾個(gè)小時(shí)，盡管這個(gè)數(shù)字的精確確定需要進(jìn)一步調(diào)查。
圖|基于線性蛋白質(zhì)自組裝的細(xì)胞生理記錄設(shè)備的概念和發(fā)展
總之，這兩篇論文開創(chuàng)了在1-7天的時(shí)間段內(nèi)測(cè)量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄歷史的方法，而不需要費(fèi)力的步驟或昂貴的設(shè)備。這些系統(tǒng)在完整的細(xì)胞環(huán)境中保存生理信息，例如細(xì)胞類型或空間位置。盡管當(dāng)前版本的技術(shù)可能無法監(jiān)測(cè)多周的活動(dòng)歷史或報(bào)告外源刺激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)以外的活動(dòng)，但這一概念有很大的潛力以許多不同的方式應(yīng)用。人們可以設(shè)想未來的發(fā)展，其允許創(chuàng)建各種幾何形狀的蛋白質(zhì)組件或包括控制組件生長(zhǎng)速率的機(jī)制。還可以使用多種誘導(dǎo)劑，例如其他藥物、鈣或光誘導(dǎo)系統(tǒng)，以便蛋白質(zhì)鏈可以記錄各種細(xì)胞事件。以這些方式對(duì)記錄進(jìn)行多路復(fù)用有望使細(xì)胞生命的歷史變得越來越豐富。
參考文獻(xiàn)：
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