營養對生長至關重要，在幼年生長期由于營養和機體激素信號之間的相互作用使得生長發育迅速進行。在哺乳動物中，出生后的生長受促生長軸的活動控制，其中生長激素影響肝臟和外周組織產生胰島素樣生長因子-1以促進器官和全身生長。急性營養不良會導致消瘦，即嚴重的體重減輕。而慢性營養不良則會引發生長激素抵抗狀態，從而導致發育遲緩。即使營養狀態恢復也無法完全解除生長激素抵抗，難以挽救患者的生長發育狀態。這個現象與腸道微生物特征群落似乎存在著必然聯系，然而其對出生后正常發育生長的貢獻及其對慢性營養不良期間促生長軸活動的影響仍然未知。
2016年法國里昂高等師范學院的FRAN?OIS LEULIER教授在Science上發表了植物乳桿菌可以增強慢性營養不良小鼠生長激素敏感性的研究成果（Lactobacillus plantarum strain maintains growth of infant mice during chronic undernutrition）。時隔六年，該團隊再次在Science上發表植物乳桿菌促進營養不良小鼠生長發育的相關工作。作者團隊補充了植物乳桿菌（LpWJL株）對抗營養不良缺陷生長的機制，并進一步探究這種特定菌群作用的分子生物學機制。LpWJL菌株中分離的胞壁酰二肽與米伐木肽單獨應用依舊可以引發整菌誘導的相同作用，并且該機制與腸上皮細胞的NOD2蛋白息息相關。這預示著，純化的植物乳桿菌細胞壁多肽或者NOD2配體再配合上營養補充，可以有效挽救慢性營養不良對患者生長發育的負面影響。
示意圖
改良飲食誘導的小鼠發育不良模型：
作者團隊首先構建了一種更加貼合現實患者病歷的傳統小鼠慢性營養不良模型，設計一種基于AIN93G的低脂肪和蛋白質的改良等熱量飲食（MAL）。與AIN93G常規飲食（CON）小鼠相比，MAL飲食小鼠的體重和體重增加發生了嚴重降低。出生后第56天MAL小鼠發育遲緩，體型和股骨長度更短。隨著整體體重增加降低，單個器官的最終重量也降低。這種發育遲緩不是食物攝入量變化的結果，甚至MAL組的相對食物攝入量有所增加。
生長因子IGF-1是出生后生長主要內分泌的決定因素，營養不良時其產量和活性降低。外周組織中的IGF-1產生由GH信號激活，生長激素受體在發育遲緩小鼠肝臟中的表達顯著降低。肝臟是循環IGF-1的主要來源，但MAL組的肝臟重量更低，血清、肌肉和肝臟中的IGF-1水平也較低，表明MAL組肝臟產生IGF-1能力受到抑制。與CON組相比，MAL組禁食后的胰島素和葡萄糖循環水平顯著降低。總之，作者團隊為了進一步研究植物乳桿菌作用機制，建立了一種新的小鼠慢性營養不良臨床前模型，該模型會導致嚴重發育不良，與IGF-1和胰島素水平低有關。
圖 低蛋白和脂肪飲食可誘導C57Bl / 6J幼年雄性小鼠發育遲緩
LpWJL治療改善生長發育：
作者團隊先前的工作已經證明了，LpWJL菌株在營養缺乏的情況下維持果蠅幼蟲的生長和發育（Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing）。在慢性營養不良的無腸道菌群小鼠模型中也觀察到這種菌株促進生長的特性。
進一步驗證其在傳統的營養不良小鼠模型中是否仍保留其對幼年生長的正面作用。LpWJL給藥使得實驗組在8周齡時比安慰劑組長3.5%，重10%，改善了小鼠的生長與體重。在治療5周后，LpWJL給藥導致股骨變長，腎臟、附睪脂肪和肌肉組織質量增加。必須要提到的是不同組別之間的食物攝入量或相對食物攝入量沒有顯著差異性。接下來，作者團隊驗證了LpWJL治療對MAL喂養小鼠的IGF-1和胰島素循環水平以及相關信號通路影響。與安慰劑組相比，LpWJL治療小鼠血清中IGF-1水平顯著增加，肝臟的IGF-1和GHR相對表達也在中增加，表明GH敏感性更高。生長激素信號通路轉錄靶基因Socs1、Socs2和Socs3表達增加的支持了上述推斷。同時肝臟中Akt的Ser473點位磷酸化顯著增加，這伴隨著血清中空腹胰島素水平的增加，表明這些動物中InR/IGF-1R通路的活性更高。因此，LpWJL治療改善了血糖控制，這反映在腹腔內葡萄糖注射后更快的葡萄糖清除。這些數據與最近的一項臨床研究一致，在該研究中，作者報告了接受微生物群指導食物治療的嚴重急性營養不良孟加拉國兒童IGF-1和胰島素水平的顯著增加。
圖 LpWJL治療改善出生后營養不良小鼠生長發育
LpWJL的促生長作用基于細胞壁組分，并存在菌株特異性：
由于作者先前的工作在果蠅模型上證明了植物乳桿菌的促進生長作用存在菌株特異性。為了確定這種菌株特異性在常規小鼠中是否也成立，使用植物乳桿菌LpNIZO2877進行驗證。與安慰劑治療類似，LpNIZO2877的給藥對體長和股骨生長沒有影響。LpWJL和LpNIZO2877維持血清IGF-1和胰島素水平的能力不同。LpNIZO2877治療對MAL小鼠的血糖控制沒有影響，在葡萄糖耐量試驗期間的葡萄糖清除沒有顯著作用。這些數據表明，在傳統營養不良動物模型中，植物乳桿菌的生長促進特性是菌株特異性的。
在果蠅模型中發現，植物乳桿菌細胞壁（CW）片段與宿主之間的相互作用在植物乳桿菌介導的生長促進中起著重要作用。熱滅活（HK）LpWJL處理MAL小鼠。HK LpWJL治療效果與活LpWJL治療效果相近，HK細菌治療導致血清中IGF-1和胰島素水平升高，并在葡萄糖耐量試驗期間降低血糖。從LpWJL或LpNIZO2877中分離出CW并給藥MAL小鼠。與安慰劑治療組相比，LpWJL CW治療顯著增加體長增長率與股骨長度，并升高血清中IGF-1和胰島素水平升高。而LpNIZO2877 CW治療沒有顯著效應。這些數據表明，LpWJ分離的CW足以支持慢性營養不良期間改善生長和葡萄糖代謝。
圖 LpWJL促進生長和代謝作用是菌株特異性的，可通過分離細胞壁重現效應
NOD2是LpWJL介導的生長促進所必需的：
HK LpWJL和從LpWJ分離的CW可以被宿主識別，并誘導代謝和激素變化，從而改善慢性營養不良期間的生長動力學。依據先前報道的文獻，確定了一組與細菌CW識別的先天免疫受體。與LpNIZO2877CW相比，LpWJL CW顯著增加了NOD2受體介導的信號傳遞。進一步驗證NOD2介導的信號通路在LpWJL改善生長動力學中的必要性，使用NOD2缺陷（NOD2?/?）小鼠。對照組為（MyD88?/?）缺陷小鼠，MyD88為對幾個TLR信號傳導至關重要的適配分子。與安慰劑治療組相比，NOD2?/?小鼠未能從LpWJL治療中獲益。LpWJL治療的NOD2?/?小鼠血清中IGF-1和胰島素無顯著變化。與NOD2?/?小鼠相比，營養不良的MyD88?/?小鼠受益于LpWJL治療。
使用NOD2活化衍生物細菌CW衍生的胞壁酰二肽（MDP）或NOD2激活佐劑米伐木肽治療小鼠模擬LpWJL的療效。MDP給藥小鼠的體長和股骨長度有所改善，但沒有達到LpWJL治療小鼠的程度。MDP給藥增加IGF-1水平，但未能增加胰島素水平或葡萄糖清除率。米伐木肽治療效果類似，IGF-1和胰島素均增加但葡萄糖清除率沒有差異。這些結果證實NOD2介導的信號傳導對于LpWJL介導的生長促進和代謝效應是必要的，并且合成的NOD2配體可以部分模擬LpWJL效應。
圖NOD2對LpWJL介導的生長促進和代謝效應是必要的
NOD2是LpWJL促進小腸Ki67細胞數量增加所必需的：
與CON喂養的動物相比，MAL喂養的小鼠小腸隱窩中的Ki67細胞數量較少，這表明在慢性營養不良期間，腸上皮的更新率較低，腸干細胞（ISC）的功能也有所改變。此前也有報道稱，小腸隱窩中的NOD2刺激有助于ISC的生存和功能。通過轉錄組分析，發現LpWJL治療上調了I型干擾素相關基因。NOD2的刺激已被證明可誘導I型干擾素應答，同時I型干擾素在腸上皮穩態中發揮重要作用。LpWJL治療的野生型小鼠每個腸隱窩中Ki67細胞的數量增加，對于NOD2?/?小鼠每個腸隱窩中Ki67細胞數目與對照組無顯著差異。此外，LpWJL治療的野生型小鼠上調了Ifit3、Ifit1和Igtp的表達。
圖 NOD2依賴性LpWJL治療促進小腸中Ki67細胞增殖和I型IFN相關基因表達
腸道局部組織中表達NOD2是LpWJL介導的生長促進所必需的：
在WT和NOD2?/?小鼠中觀察到的LpWJL治療后小腸的變化表明，腸隱窩中NOD2的信號介導可能是LpWJL改善慢性營養不良期間生長動力學的關鍵。使用組織特異性NOD2 KO策略，構建NOD2的腸上皮細胞（IEC）特異性Cre驅動基因耗竭（NOD2ΔIEC）模型。LpWJL治療的NOD2fl/fl小鼠體長增長率與IGF-1水平有所提高，而安慰劑和LpWJL治療的NOD2ΔIEC組之間沒有顯著差異性。與所有其他組相比，LpWJL處理的NOD2fl/fl小鼠腸隱窩中的Ki67細胞數量顯著增加，I型IFN相關基因的表達增加。這些結果表明，腸上皮細胞室需要NOD2來支持LpWJL介導的腸道反應和生長促進。
圖 腸隱窩中LpWJL的NOD2依賴性信號介導的必要性
小結：
作者團隊的實驗結果證實，用細菌菌株LpWJL或其CW治療通過協調幼年宿主的代謝和激素變化，提高IGF-1和胰島素的循環水平，以支持慢性營養不良幼鼠的出生后生長。純化CW支持生長的能力，以及細菌介導的生長促進表型的菌株特異性，表明宿主機制在識別細菌CW以緩解慢性營養不良時的發育遲緩方面發揮了重要作用。作者團隊證明了細菌CW的關鍵信號傳導分子NOD2對于LpWJL促進生長是必要的，并且NOD2配體亦可改善的生長。這項發現可以與補充營養策略相結合，使用益生菌（如LpWJL）或相關信號受體激動劑（如LpWJLCW和NOD2激動劑）極有可能解除慢性營養不良對生長發育造成的長期干擾。這將造福中低收入國家近乎1.49億的5歲以下營養不良的兒童。
NOD2是一種在腸上皮細胞和免疫細胞中表達的固有免疫受體，可維持腸道炎癥和免疫穩態。慢性營養不良會減少增殖性ISC的數量，導致絨毛變短，吸收上皮細胞數量減少，總體上導致小腸吸收面積減少，營養吸收減少。而NOD2也在腸隱窩的ISC中高表達，LpWJL治療促使小腸隱窩中Ki67數量的增加，但在NOD2?/?小鼠中治療無效。因此LpWJL很有可能是通過NOD2依賴性細菌細胞壁組分識別對抗營養不足對小腸隱窩細胞增殖的負面影響，從而改善了營養吸收，表現為營養敏感的GH/IGF-1/胰島素軸活性增加。然而，這一假設需要進一步驗證。
參考文獻：
（本文）Martin Schwarzer, Umesh Kumar Gautam, Kassem Makki, et al. Microbe-mediated intestinal NOD2 stimulation improves linear growth of undernourished infant mice. Science. 2023 Feb 24;379(6634):826-833.
https://www.science.org/doi/10.1126/science.ade9767
（前置研究）Martin Schwarzer, Kassem Makki, Gilles Storelli, et al. Lactobacillus plantarum strain maintains growth of infant mice during chronic undernutrition. Science. 2016 Feb 19;351(6275):854-7.
https://www.science.org/doi/10.1126/science.aad8588
（前置研究）Gilles Storelli 1, Arnaud Defaye, Berra Erkosar, et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 2011 Sep 7;14(3):403-14.
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1550-4131(11)00306-8
