T細胞最初通過T細胞受體（TCR）與抗原呈遞細胞（APC）表面的載肽主要組織相容性復合物（pMHC）的結合而獲得適應性免疫。pMHC的參與可以誘導TCR復合物胞質域中基于酪氨酸的免疫受體激活基序（ITAMs）的磷酸化（一個稱為TCR觸發的過程），導致ZAP70募集以觸發最終導致T細胞激活的信號通路級聯。盡管在T細胞免疫中起著重要作用，但TCR–pMHC參與如何啟動細胞內信號級聯的分子機制仍存在爭議。
TCR-pMHC相互作用的許多特征，如構象改變、結合親和力和結合動力學，已經在TCR觸發的背景下進行了研究，其軸向尺寸（垂直于兩個膜的平面）被認為是關鍵決定因素之一。在 TCR-pMHC 連接中，多個輔助分子被募集以在 APC 和 T 細胞之間的界面處形成緊密接觸區域。TCR-pMHC 復合體的小尺寸意味著細胞接觸保持在 ~13nm 的短膜間距內。 這個距離將在空間上排除具有大胞外域的細胞表面分子，例如酪氨酸磷酸酶 CD45。動力學分離模型假定從接觸區排除 CD45 對于促進下游信號傳導的延長 ITAM 磷酸化至關重要。同時，可能會產生機械力，因為從緊密接觸區分離或壓縮的大分子將難以擴散或拉直。這種力可以促進連接的 TCR 復合物的構象變化，以加強 T 細胞活化。
人工納米制造表面可以提供可測量的模型，但它們缺乏許多固有的膜相關分子和適應性形態，不可避免地導致代表真實 APC 的局限性。此外，迄今為止報道的策略僅側重于延長膜間距，但很少有人試圖探索相反操作引起的效果，在機制研究中留下了不可避免的空白。事實上，在真實的 APC-T 細胞相互作用系統中使用更寬的窗口來操縱接觸區的尺寸，但對細胞狀態的干擾最小化的能力將使我們能夠更好地理解 T 細胞信號傳導。
成果簡介：
鑒于此，湖南大學譚蔚泓院士、邱麗萍等人設計了一系列具有不同尺寸的 DNA 納米連接 (DNJ)，以精確控制 APC-T 細胞界面處的膜間距。
構建和表征不同大小的 TDN
這些 DNJ 是通過兩個膜錨定四面體 DNA 納米結構 (TDN) 之間的 DNA 雜交形成的，這些結構是通過DNA自組裝構建的，頂部頂點有 17 個核苷酸突出端，三個底部頂點有膽固醇標簽。這些兩親性TDN可以通過膽固醇標簽和磷脂雙層之間的疏水相互作用錨定在細胞膜上。四面體的機械剛度和幾何穩定性提供了一種可靠的具有確定尺寸的膜錨定納米支架。
為了精確調整膜間距，研究人員設計了三個等邊 TDN，即 TDN-7、TDN-13 和 TDN-37，每個邊分別由 7、13 和 37 個堿基對組成。三種類型的 DNJ，稱為 DNJ-7、DNJ-13和 DNJ-37，是通過組合兩個相同大小的互補TDN構建的，它們的理論高度分別計算為 9.8、13.0 和 26.4nm。
作者使用凝膠電泳、原子力顯微鏡和動態光散射來確認三種不同 TDN 的形成和大小。然后，他們通過在細胞與含有膽固醇的 FAM 標記的 TDN 孵育后觀察細胞膜上的強熒光信號，證明了膽固醇在 TDN 有效膜錨定中的重要性。作者還表明，具有三個間隔錨定位點的 TDN 為細胞表面工程提供了可靠的平臺。他們使用濃度為200 nM的TDN持續 20 分鐘，實現了高膜錨定效率和飽和度。作者還評估了這種膜修飾策略對兩種主要免疫細胞的普遍性：樹突狀細胞和 CD8+ T 細胞。所有三種 TDN 都可以快速有效地錨定在兩種免疫細胞的膜上，證明了這種膜錨定納米平臺用于研究DC-T 細胞相互作用的可靠性。
圖|用于細胞表面工程的TDN的構建和表征
構建用于操縱膜間距的DNJ
研究證實，DNJ 可以通過互補 TDN 的雜交形成，并且它們可以控制細胞之間的膜間距。使用可變角度全內反射熒光顯微鏡 (VA-TIRFM) 和不同分子量的熒光素-異硫氰酸酯標記的葡聚糖測量 DNJ-7、DNJ-13 和DNJ-37 產生的膜間距。結果顯示 DNJ 大小與膜間距離呈正相關，測量的距離與其預期值匹配良好。TEM成像證實了 DNJ 介導的細胞界面存在空間間隙。總體而言，該研究表明 DNJ 有可能用作控制細胞間相互作用的工具。
圖|構建用于操縱膜間距的DNJ
使用DNJ調節T細胞活化
研究人員測試了四種卵清蛋白肽（N4、Y3、Q4 和 T4）作為與 DC 和 OT-I T 細胞的細胞相互作用系統的抗原信號。他們發現 Q4 誘導了恒定的 T 細胞刺激傾向，并被選為后續研究的抗原肽。接下來，他們測試了飽和表面密度的DNJs對T細胞活化的影響。他們發現，所有三個DNJs都增強了T細胞增殖，但DNJ-7引起了最高的增殖率，DNJ-13表現優于DNJ-37。研究人員還觀察到，飽和表面密度的DNJs通過促進DC-T細胞粘附來促進T細胞刺激。
圖|高密度DNJ對T細胞活化的影響
膜間距離介導的T細胞活化
隨后研究人員使用 DNA 納米技術研究了膜間距對 T 細胞活化的影響。通過滴定 DNJ對 DC 和 T 細胞的濃度，研究人員發現將 DNJ 濃度降低至≤10nM 可以消除細胞間粘附并為 T 細胞活化創造關鍵條件。他們還構建了一個人工 T 細胞激活系統，使用 SLB 包被的微珠和分裂 TDN 來控制具有時空精度的膜間距。實驗表明，DNJ對T細胞激活的影響是通過調節間膜間距離實現的。
圖|用DNJ介導的膜間距離調節T細胞活化
TCR信號傳導的可能分子機制
研究人員通過在T細胞與樹突狀細胞之間接觸區域添加不同大小的DNJs，研究了它們對T細胞信號傳導的影響。實驗結果表明，DNJ-7可以使接觸區域的外圍嚴格排斥CD45，并且還可以在不影響抗原結合的前提下將接觸區域軸向壓縮，從而增強T細胞信號傳導。相比之下，DNJ-13可以穩定樹突狀細胞和T細胞之間的pMHC結合界面，從而實現更強的T細胞刺激。DNJ-37雖然能夠拉伸接觸區域，但不能有效地促進T細胞信號傳導。這些結果表明，接觸區域的尺寸和穩定性對調節T細胞信號傳導至關重要。
圖|研究TCR信號傳導的分子機制
小結：
通過使用膽固醇結合的 TDN 作為膜錨定支架，研究人員構建了不同大小的 DNJ，并在真實的 DC-T 細胞相互作用系統中操縱了 TCR-pMHC 維度周圍的膜間距。與傳統的基因工程策略不同，該系統不需要蛋白質修飾，并且這些 DNA 納米結構可以高效快速地錨定在細胞膜上，對細胞環境的干擾最小。在臨界低表面密度下，尺寸超過 TCR-pMHC 復合物尺寸的 DNJ-37 可以延長膜間距離，從而導致抑制 T 細胞觸發，這可能是由于 CD45 分離阻礙所致。研究人員還使用小型 DNJ-7 壓縮 DC-T 細胞界面，并實現了 T 細胞活化的改善，這可能是由于嚴格排除 CD45 和產生額外機械力的綜合作用。總之，這些結果為我們提供了直接證據，證明緊密接觸區的軸向尺寸在 T 細胞觸發中起著重要作用。憑借縮短 DC-T 細胞界面的能力，表明可以將更廣泛的研究窗口應用于 T 細胞免疫研究。
參考文獻;
Du, Y., Lyu, Y., Lin, J. et al. Membrane-anchored DNA nanojunctions enable closer antigen-presenting cell–T-cell contact in elevated T-cell receptor triggering. Nat. Nanotechnol. (2023).
https://doi.org/10.1038/s41565-023-01333-2
