精準(zhǔn)醫(yī)療需要開發(fā)一種準(zhǔn)確反映疾病性質(zhì)的特異性分子分類方法。統(tǒng)一的研究趨勢是獲得大量多維度分子的數(shù)據(jù)，包括DNA/RNA、蛋白質(zhì)和小分子，以實現(xiàn)大數(shù)據(jù)機械學(xué)習(xí)與疾病分類。這也引發(fā)了學(xué)界研究如何更好的利用多維度分子數(shù)據(jù)來更好地對疾病進行分類。然而，從各種技術(shù)中獲得的數(shù)據(jù)的異構(gòu)性相應(yīng)地增加，并在數(shù)據(jù)集成和解釋方面提出了巨大的挑戰(zhàn)。RNA測序和染色質(zhì)免疫沉淀測序之間的測量靈敏度存在異質(zhì)性，這就可能導(dǎo)致面對RNA測序表現(xiàn)的基因表達(dá)變異在染色質(zhì)免疫沉淀測序中無法反映。因此，廣泛的計算密集型數(shù)據(jù)過濾和系統(tǒng)歸一化對于實現(xiàn)有效的多維數(shù)據(jù)集成是必不可少的。近日，上海交通大學(xué)附屬仁濟醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究院的左小磊教授與化學(xué)化工學(xué)院的樊春海院士等人在Nature Nanotechnology報道了一種基于DNA編碼的分子分類器，可分析多維分子臨床數(shù)據(jù)。為了在異質(zhì)分子結(jié)合事件中產(chǎn)生統(tǒng)一的電化學(xué)傳感信號，利用基于DNA框架的多價態(tài)可編程納米顆粒，開發(fā)了價態(tài)編碼的信號報告分子，使幾乎任何生物分子結(jié)合事件都可以轉(zhuǎn)換為線性信號。作者團隊還演示了該分子分類器的應(yīng)用，通過分析一組跨越三維度數(shù)據(jù)類型的六個生物標(biāo)志物，實現(xiàn)了對前列腺癌患者近乎完全準(zhǔn)確的分子分類。多維分子分類器的開發(fā)基于與DNA結(jié)合相關(guān)的分子技術(shù)，這提供了一種強大且可推廣的分子分類手段。Watson-Crick堿基 DNA 配對的精度和可編程特性為具有不同成分、大小、手性和線性的膠體組裝提供了一系列價控制的可編程原子樣納米結(jié)構(gòu) （PAN）。可惜的是先前的研究報道中的此類分類器由于結(jié)合過程的異質(zhì)性，使得蛋白質(zhì)或代謝小分子維度的數(shù)據(jù)分析難以實現(xiàn)。因此，實現(xiàn)基于DNA的多維分子分類器的挑戰(zhàn)是開發(fā)一種信號報告分子來將多維分子信息轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一輸出信號。為了在異質(zhì)分子結(jié)合事件中產(chǎn)生統(tǒng)一的電化學(xué)傳感信號，作者團隊使用基于自組裝DNA四面體框架（DTF） 設(shè)計價態(tài)編碼的 PAN 報告分子，能夠通過n價態(tài)結(jié)合不同維度上的靶分子。通過對PAN報告分子的信號部分設(shè)計，允許n個信號組分結(jié)合來從物理層面實現(xiàn)權(quán)重分類。來自每個靶分子的信號強度將與PAN報告分子上的信號結(jié)合數(shù)量成線性比例，這使得不同維度分子的數(shù)目與權(quán)重得以定量。首先通過在緩沖液中混合7個58核苷酸的DNA片段和一個81核苷酸的手柄DNA片段組裝成一個包含手柄DNA的DTF。為了形成包含更多信號組分錨定位點的PAN報告分子，將一個DTF偶聯(lián)到另一個DTF上，通過兩個DTF中的接頭DNA和手柄DNA的雜交形成啞鈴形結(jié)構(gòu)的DTF二聚體。使用熒光團標(biāo)記作為信號部分，來驗證價態(tài)編碼的PAN報告分子可以與定義數(shù)量的信號基團結(jié)合。全內(nèi)反射熒光顯微鏡圖像顯示，溶液中PAN報告基因的熒光強度與信號部分的數(shù)量成線性比例。此外，由于DTF的邊緣長度為~12 nm引起的熒光團分離，不會聚集引起猝滅。類似地，單個PAN報告基因的熒光強度隨著Cy3數(shù)量從1增加到6而線性增加。此外，可以觀察到逐步單分子熒光光漂白。因此，PAN報告分子的信號部分?jǐn)?shù)量可以被精確地控制在1到6之間。接下來，驗證PAN是否具有結(jié)合正交性，以適應(yīng)編程的多色標(biāo)記。將六種熒光團錨定在單個PAN報告分子上，熒光強度和光漂白步驟與每種熒光團的數(shù)量成線性比例，彼此互不干擾。此外，在單個PAN報告基因上錨定一個Alexa Fluor 488熒光團和五個Cy5熒光團時，觀察到Alexa Fluor 488光漂白痕跡的一個步驟和Cy5光漂白痕跡的五個步驟。因此，PAN報告分子的錨定位點是單獨控制的，即使存在多個不同信號類型的情況下，也實現(xiàn)設(shè)計數(shù)量的信號組分。圖 使用PAN的價態(tài)編碼信號報告分子的設(shè)計多維分子分類器通過設(shè)計價態(tài)編碼PAN報告分子來編程多維分子的統(tǒng)一電化學(xué)傳感信號，從而將每個分子輸入信號轉(zhuǎn)換為表示其重要性的加權(quán)傳感信號。該系統(tǒng)的旨在促進探針和目標(biāo)分子之間的結(jié)合事件以觸發(fā)加權(quán)電化學(xué)信號。對于RNA（mRNA或miRNA），使用單鏈DNA探針作為識別探針，其中堿基配對相互作用靶RNA。PAN特異性地識別探針-靶復(fù)合物的突出部分，并將靶RNA的存在轉(zhuǎn)化為以HRP作為信號分子的加權(quán)電化學(xué)信號。對于蛋白質(zhì)，使用特異性單克隆抗體捕獲目標(biāo)蛋白，使用另一種抗體形成靶蛋白的抗體-蛋白質(zhì)-抗體夾心。對于小分子，使用配體-DNA雙鏈體作為識別探針。小分子與配體的結(jié)合觸發(fā)表面DNA的釋放，通過釋放的DNA和PAN的DNA接頭之間的雜交來募集PAN報告分子。在上述的捕獲識別與PAN熒光權(quán)重設(shè)計的基礎(chǔ)下，為生物相關(guān)分子的所有主要維度設(shè)計了加權(quán)系統(tǒng)，表明PAN報告分子在多維分子中權(quán)重分配的通用性。通過設(shè)計一個具有一到六個HRP的權(quán)重分配來實驗性地實現(xiàn)這種加權(quán)系統(tǒng)，使用PAN報告分子對多維分子進行分配。在添加靶標(biāo)后記錄與重量分配相對應(yīng)的電化學(xué)信號，直到獲得穩(wěn)定的電化學(xué)信號。信號與PAN上的HRP數(shù)量實現(xiàn)的權(quán)重成線性比例。進一步將加權(quán)系統(tǒng)應(yīng)用于另外12種生物標(biāo)志物，包括COVID-19生物標(biāo)志物、癌癥生物標(biāo)志物和疾病相關(guān)的miRNA（miR-21，miR-26a，miR-375，miR-144，miR-153和miR-183），并成功實現(xiàn)了電信號轉(zhuǎn)化。圖 基于PAN報告分子的多維分子加權(quán)系統(tǒng)以前列腺癌為例，實驗性驗證二維分子分類，使用前列腺特異性抗原（PSA）和MEIS2作為目標(biāo)生物標(biāo)志物。給PSA分配了+3的正權(quán)重，給MEIS2分配了-3的負(fù)權(quán)重。正權(quán)重表示正相關(guān)，負(fù)權(quán)重表示與疾病的負(fù)相關(guān)，而它們的值表示其重要性。通過混合這兩種具有不同濃度組合的生物標(biāo)志物制備了64個模擬樣品。分類器檢測結(jié)果與設(shè)計一致。接下來，嘗試擴大分子分類器的應(yīng)用，并使用多維數(shù)據(jù)對PCa患者與健康人群進行分類。使用來自Gene Expression Omnibus的公開可用的基因和miRNA分析數(shù)據(jù)，以及以前臨床的PSA和肌氨酸測量數(shù)據(jù)，用于分類器訓(xùn)練。將數(shù)據(jù)集整合到一個大型數(shù)據(jù)集中，以評估多維分子的應(yīng)用，并使用具有不同優(yōu)化重點的多個邏輯回歸模型搜索權(quán)重組合。獲得的最佳權(quán)重包括miR-153（權(quán)重= -1），miR-183（權(quán)重= +4），ROR2（權(quán)重= -2），MEIS2（權(quán)重= -3），PSA（權(quán)重= +3）和肌氨酸（權(quán)重= +1）。使用這組權(quán)重，實現(xiàn)了80%的識別靈敏度，特異性為100%，F(xiàn)1分?jǐn)?shù)為97%，ROC曲線為97%，精度為100%，驗證集的準(zhǔn)確率為95%。該分類器表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性和靈敏度，實現(xiàn)分子實施是可行的。圖 分子分類器的計算機訓(xùn)練，以區(qū)分PCa患者和健康個體首先驗證了PAN對PCa的六種生物標(biāo)志物的電信號轉(zhuǎn)換性能。miRNA的電化學(xué)信號表現(xiàn)出濃度依賴性的線性響應(yīng)，動態(tài)范圍為四個數(shù)量級。miRNA的檢測限估計為100 fM，允許直接分析真實樣品的miRNA。對mRNA，PSA和SO的靈敏檢測，動態(tài)范圍也為三到五個數(shù)量級。mRNA 的檢測限降至 1 pM，PSA為0.05 ng ml–1，SO為10 nM。電化學(xué)信號也與每種生物標(biāo)志物的權(quán)重呈正相關(guān)，以此確定了六種生物標(biāo)志物的權(quán)重分配。對來自32名PCa患者和50名健康個體的真實臨床樣本進行分子分類。實現(xiàn)了PCa患者和健康個體之間的準(zhǔn)確分類。ROC曲線表明具有很高的預(yù)測能力，AUC為100%。多維度分子分類獲得了近乎100%的特異性和100%的靈敏度，并具有最佳臨界值。相比之下，單個miRNA（miR-183）獲得的AUC僅為54%。。生物標(biāo)志物組合有可能區(qū)分各種疾病過程中的患者，合理設(shè)計具有最優(yōu)權(quán)重的生物標(biāo)志物組合，更準(zhǔn)確地反映了包括癌癥在內(nèi)的多種疾病過程。然而，篩選每種生物標(biāo)志物的最佳權(quán)重具有挑戰(zhàn)性。使用來自12名PCa患者的血清樣本來實驗性的篩選生物標(biāo)志物組合的最佳權(quán)重。樣本包括四個格里森評分為6的樣本，四個格里森評分為7的樣本和四個格里森評分為8或9的樣本。使用一組miRNA（miR-32，miR-96，miR-153，miR-183）作為模型系統(tǒng)，并使用PAN的加權(quán)系統(tǒng)為每個miRNA分配權(quán)重。不同權(quán)重組合的miRNA加權(quán)信號為2，048個組合。聚類分析來篩選生物標(biāo)志物組合的最佳加權(quán)集。前五名相關(guān)分析允許根據(jù)格里森分?jǐn)?shù)對三組進行分類，最佳加權(quán)結(jié)果為 miR-32權(quán)重+3，miR-96權(quán)重-1，miR-153權(quán)重+1，miR-183權(quán)重-2。該分子分類器擁有著進行生物標(biāo)志物組篩選的能力。圖 使用PAN報告分子進行PCa診斷標(biāo)志物組篩查綜上所述，作者團隊通過利用DNA框架開發(fā)了價態(tài)編碼PAN信號報告分子，為解決異質(zhì)分子結(jié)合事件中信號類型不統(tǒng)一挑戰(zhàn)提供了一種解決思路。通過價態(tài)編碼從物理層面實現(xiàn)了權(quán)重賦予，以實現(xiàn)多維分子分類，從而通過跨三維數(shù)據(jù)類型的六個生物標(biāo)志物進行精確的PCa診斷（AUC為100%）。同時也實現(xiàn)了針對PCa多種生物標(biāo)記物的權(quán)重分析，進以構(gòu)建并不斷優(yōu)化現(xiàn)有的診斷生物標(biāo)記物組的組成。鑒于來自疾病的基因、RNA、蛋白質(zhì)和代謝組學(xué)譜的分子信息量不斷增加，分析多維分子生物標(biāo)志物的多維分子分類器為精準(zhǔn)診斷和治療提供了啟示。Fangfei Yin, Haipei Zhao, Shasha Lu, et al. DNA-framework-based multidimensional molecular classifiers for cancer diagnosis. Nat Nanotechnol. 2023 Mar 27.https://www.nature.com/articles/s41565-023-01348-9
