碳納米管 (CNT) 在電子、材料科學、生物學和醫學等多個領域的應用引起了人們的極大興趣。然而，由于它們可能具有毒性和在自然界中的持久性，國際化學秘書處 (ChemSec) 最近將 CNT 添加到 SIN（“立即替代”）化學品清單中，建議在未進行人體健康風險評估的情況下不應使用 CNT。因此，需要額外的努力來了解CNT與可能誘發炎癥和控制毒性的人類分子之間的相互作用。這些知識對于設計和開發更安全的 CNT 至關重要。
先前的報告表明，長而硬的多壁碳納米管 (MWCNT) 在嚙齒動物中具有類似石棉的致病性。與石棉一樣，在腹腔注射后，多壁碳納米管優先被巨噬細胞吞噬，隨后的巨噬細胞炎癥反應被認為會引起慢性炎癥，從而導致間皮瘤。事實上，體外研究表明，MWCNT 和石棉都會立即被巨噬細胞吞噬并誘導細胞焦亡和 Nlrp3 炎性體激活，從而導致白細胞介素 1β (IL-1β) 分泌。然而，人們對巨噬細胞如何識別其細胞表面的多壁碳納米管知之甚少。
近日，研究人員將 T 細胞粘蛋白免疫球蛋白 (Ig) 4 (Tim4) 和 Tim1 磷脂酰絲氨酸受體鑒定為小鼠中的CNT識別受體。這些受體的獨特之處在于它們在其頂端位置具有一簇芳香族殘基，有助于直接識別 CNT。值得注意的是，通過抗Tim4單克隆抗體 (mAb) 掩蔽Tim4或Tim4基因缺失可改善CNT誘導的腹膜炎癥和肉芽腫形成，突出了巨噬細胞吞噬 CNT 在其毒性中的關鍵作用。然而，在人類中，尚不清楚 Tim4 是否參與此過程，因為 Tim4 mRNA 水平在人外周血單核細胞 (PBMC) 和肺組織中處于邊緣狀態。
之前，研究人員使用了長而硬的多壁碳納米管（132 ± 47 nm× 5.1 ± 2.4 μm）對其進行了詳細表征，并觀察到人外周血（PB）單核細胞有效地吞噬了這些MWCNT，然后分泌IL-1β， 盡管 Tim4 和Tim1 都不在其細胞表面表達。因此，這表明存在未知的人類 CNT 識別受體。 鑒于 Tim4 和 Tim1 的獨特結構，其頂端包含一簇芳香殘基，研究人員假設這樣的簇對于 CNT 識別至關重要。因此，在目前的工作中，立命館大學Masafumi Nakayama、日本煙草公司Kota Kasahara等研究人員主要是尋找含有芳香簇的Tim4樣受體。
計算機篩選和 AlphaFold 建模將Siglec-5 和 Siglec-14 識別為 CNT 結合受體
研究人員進行了基于三維蛋白質結構的計算機篩選。通過蛋白質數據庫(PDB)和 GO分析，以及視覺篩選，以識別在其頂端位置含有此類簇的 Tim4 樣受體，并最終分離出唾液酸 Ig 樣結合凝集素 (Siglec)-5 和 Siglec-3。
盡管已知 Siglec 受體可以識別各種含唾液酸的聚糖并在免疫細胞信號傳導中發揮關鍵作用，但它們是否識別 CNT 仍然未知。因此，研究人員用人 Siglec-5 或 Siglec-3 重建了 NIH-3T3 細胞。引人注目的是，Siglec-5而非Siglec-3 的表達使 NIH-3T3 細胞能夠識別 MWCNT。此外，Siglec-5/NIH-3T3 細胞的 MWCNT 結合活性高于Tim4/NIH-3T3 細胞。
圖|將 Siglec-5 鑒定為 CNT 識別受體
研究人員并使用MD模擬和體外結合試驗來解析其結合過程。研究人員調查了兩個 Siglec-5 突變體 WY50/51AA 和 WYYY50/51/68/69AAA，以檢查這些芳香簇對結合的重要性。結果表明，這兩種芳族簇加起來有助于識別 CNT 表面，并且它們的損失會導致結合的顯著不穩定。因此，這突出了一種由多種芳香-芳香相互作用介導的新型納米-生物界面。
圖|MD 模擬和體外驗證以闡明 Siglec-5 與 MWCNT 的結合模式
研究人員還探索了其他 Siglec 是否也能識別 CNT。研究發現，Siglec-14 的 V 組 Ig 樣結構域與 Siglec-5 具有 100% 的氨基酸同一性，不出所料，Siglec-14 和 Siglec-5 的表達使細胞能夠識別 MWCNT。
圖|Siglec-14，而不是 Siglec-5，吞噬多壁碳納米管以誘導 IL-1β 分泌和肺部炎癥
Siglec-14 介導 MWCNT 的吞噬作用并引發炎癥
值得注意的是，Siglec-14 通過帶有基于酪氨酸的激活基序 (ITAM) 的 DAP12 傳遞激活信號，因此 Siglec-14 可能參與 MWCNT 誘導的炎癥。相反，Siglec-5 在細胞質結構域中具有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序 (ITIM)，因此可以抑制炎癥。為了解決這些配對受體的功能，研究人員構建了 THP-1細胞，一種穩定表達 Siglec-5 或 Siglec-14 的人單核細胞系。有趣的是，Siglec-14 被發現介導 NF-κB 激活，如 IκB-α 的瞬時降解所示，并誘導 IL-8 分泌以響應 MWCNT。另一方面，Siglec-5 對這些促炎反應沒有顯著影響。總之，這些結果表明 Siglec-14 響應于 MWCNT 傳遞炎癥信號。值得注意的是，Siglec-14 蛋白被 MWCNT 下調，而 Siglec-5 蛋白的表達沒有變化。考慮到細胞表面 Siglec-14 的快速下調，該受體可能被內化和降解。實際上，盡管在 MWCNT 識別方面，Siglec-5 和 Siglec-14 之間沒有顯著差異，但 Siglec-14 顯著誘導了 MWCNT 的吞沒，而 Siglec-5 僅結合 MWCNT。
為了解決 Siglec-14 的體內作用，研究人員通過使用慢病毒轉導系統生成了在約 30% 的 Siglec-F+ 肺泡巨噬細胞上穩定表達 Siglec-14 的小鼠。當這些小鼠氣管內 (i.t.) 注射多壁碳納米管時，Siglec-14轉導的巨噬細胞在體內比未轉導的巨噬細胞更有效地識別多壁碳納米管。注射后第 1 天，與模擬轉導小鼠相比，Siglec-14 轉導小鼠的支氣管肺泡灌洗液 (BALF) 中的 IL-1β顯著增加。與此一致，肺組織的H&E染色顯示在 Siglec-14 轉導小鼠的肺泡腔中有炎癥細胞積聚。總之，這些結果表明 Siglec-14 介導肺部炎癥以響應 MWCNT。
圖|Siglec-14 介導的人單核細胞對多壁碳納米管的識別
Syk抑制劑福他替尼減弱Siglec-14 介導的對多壁碳納米管的炎癥反應
鑒于脾臟酪氨酸激酶 (Syk) 可能參與 Siglec-14-DAP12 信號傳導，研究人員使用 CRISPR/Cas9 系統生成了 Syk 無效細胞。Syk缺失不影響 Siglec-14 的細胞表面表達，但會顯著降低 MWCNT 的吞噬作用和隨后的 IL-1β 分泌，表明 Syk 信號傳導的重要作用。這一發現促使研究人員解決 Syk 是否可以成為治療目標的問題。正如所料，R406 是 FDA 批準的 Syk 抑制劑福他替尼 R788 的活性代謝物，它以劑量依賴的方式顯著阻斷 S14+/-供體 PBMC 以及 Siglec-14/THP-1 細胞分泌 IL-1β。另一方面，R406 不影響尼日利亞菌素或 ATP 誘導的 IL-1β 分泌，排除了非特異性毒性作用的可能性。此外，口服 R788 可顯著降低 MWCNT 誘導的 Siglec-14 轉導小鼠 BALF 中 IL-1β 和 TNF-α 的分泌。這些數據表明，福他替尼在體外和體內抑制 Siglec-14 介導的對多壁碳納米管的炎癥反應。
Siglec-14-Syk 介導的對多壁碳納米管的炎癥反應被福他替尼阻斷
多壁碳納米管與單壁碳納米管的毒性差異
與多壁碳納米管相比，單壁 (SW) 碳納米管被認為毒性較低。因此，作者還評估了單壁碳納米管的生物學效應。WCNT連接 Siglec-14 以誘導 IL-8 分泌，但內化的 SWCNT 不會引起溶酶體損傷和相關的 IL-1β 分泌。另一方面，據報道，單壁碳納米管會導致線粒體損傷。因此，細胞內事件而非細胞表面識別可以解釋 MWCNT 和 SWCNT 之間的毒性差異。
小結
綜上所述，研究人員證明 Siglec-14 通過細胞外芳香簇識別 CNT，從而引發炎癥。值得注意的是，據報道碳納米材料通過芳香-芳香相互作用結合可溶性蛋白質的芳香基團，其方式與 Siglec-5/14-CNT 相互作用相同。因此，Siglec-14 可能與蛋白冠的芳香基團競爭或結合，以分別直接或間接識別 CNT。因此，這項研究強調了芳香簇在 Siglec 分子的受體細胞外環中對 CNT 識別的重要性。
CNT是具有廣泛潛在應用的創新工具，大多數人可能會對它們產生反應。Anti-Siglec-14 mAb 和福他替尼可能是控制 CNT 毒性的治療和預防工具。
參考文獻：
Yamaguchi, SI., Xie, Q., Ito, F. et al. Carbon nanotube recognition by human Siglec-14 provokes inflammation. Nat. Nanotechnol. (2023).
https://doi.org/10.1038/s41565-023-01363-w
