再生機(jī)器人是一個(gè)活躍的新興領(lǐng)域，旨在開發(fā)可以通過利用身體的生物物理傳感能力來促進(jìn)組織愈合的技術(shù)。基于機(jī)器人的非侵入性機(jī)械負(fù)荷（ML）療法（也稱為“機(jī)械療法”）的開發(fā)已被探索，特別是用于骨骼肌修復(fù)，因?yàn)槠鋵C(jī)械線索的敏感性眾所周知。肌肉干細(xì)胞對ML的反應(yīng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的激活和增殖行為，并機(jī)械療法已被證明通過增強(qiáng)肌肉功能，改善受損肌纖維的結(jié)構(gòu)修復(fù)以及減少組織纖維化來實(shí)現(xiàn)損傷后治療。然而，迄今為止關(guān)于這些療法及其機(jī)制的大部分?jǐn)?shù)據(jù)都來自對年輕動(dòng)物的研究。鑒于隨著年齡的增長和老年人口的不斷增長而發(fā)生的許多生理變化，更好地了解再生機(jī)器人療法如何發(fā)揮其生物效應(yīng)以及這些效應(yīng)如何隨著身體年齡的增長而變化對于為不同年齡組的臨床研究提供信息至關(guān)重要。
近日，哈佛大學(xué)約翰·A·保爾森工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院的David. J. Mooney院士率領(lǐng)其團(tuán)隊(duì)在Science Robotics上發(fā)表了一項(xiàng)關(guān)于機(jī)器人驅(qū)動(dòng)的機(jī)械負(fù)荷（ML）療法在老化骨骼肌再生中的研究工作。基于先前關(guān)于ML在年輕肌肉再生中的免疫調(diào)節(jié)作用的研究，假設(shè)ML將通過下調(diào)慢性衰老炎癥反應(yīng)來促進(jìn)衰老肌肉修復(fù)，同時(shí)刺激老年干細(xì)胞群。在對ML的反應(yīng)下，在受傷的老年肌肉中發(fā)現(xiàn)炎癥顯著加重，以及老年肌肉干細(xì)胞再生行為的受阻。雖然機(jī)器人驅(qū)動(dòng)的ML本身阻礙了老化的肌肉再生，但將ML與糖皮質(zhì)激素（GC）療法相結(jié)合，對抗ML引發(fā)的炎癥副作用可以逆轉(zhuǎn)這些負(fù)面影響，并使嚴(yán)重?fù)p傷后的衰老肌肉再生成為可能。
老化肌肉在嚴(yán)重受傷后表現(xiàn)出愈合受損和免疫反應(yīng)改變：
首先研究年輕（2至3個(gè)月大）和老年（20至22個(gè)月大）動(dòng)物嚴(yán)重受傷肌肉恢復(fù)的差異。受傷后14天，受傷年輕肌肉的收縮力與未受傷組無顯著性差異。但是到第21天，受傷老化肌肉也不能產(chǎn)生大于未受傷組35%的收縮力。此外，在連續(xù)刺激后，與年輕肌肉相比老化肌肉的抗疲勞性顯著降低。老化肌肉表現(xiàn)出比年輕肌肉更高的受損肌纖維百分比和纖維化、更嚴(yán)重的鈣化和脂肪沉積。未受傷老年和年輕肌肉中的總肌肉干細(xì)胞相似，但在受傷后3天觀察到年輕肌肉中肌肉干細(xì)胞明顯增殖。
由于肌肉損傷炎癥反應(yīng)是決定再生的關(guān)鍵因素。受傷年輕肌肉中的總免疫細(xì)胞在第3天達(dá)到峰值，隨后下降到基線。然而，在老化肌肉中第3天的免疫細(xì)胞數(shù)量顯著降低，并且在第7天達(dá)到較晚的峰值。中性粒細(xì)胞是炎癥級聯(lián)反應(yīng)中最早的反應(yīng)者，在第1天觀察到年輕肌肉中數(shù)量明顯高于老化肌肉。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是肌肉干細(xì)胞行為的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，第3天年輕肌肉中達(dá)到頂峰。然而在老化的肌肉中，這些細(xì)胞峰值發(fā)生在第7天和第10天之間，隨后是炎癥消退的延遲，細(xì)胞數(shù)恢復(fù)到未受傷基線值的速度較慢。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了老年肌肉嚴(yán)重?fù)p傷后的恢復(fù)受損與炎癥消退延遲。
圖 老化骨骼肌在受傷后表現(xiàn)出愈合受損和炎癥消退障礙
機(jī)器人驅(qū)動(dòng)的ML僅促進(jìn)嚴(yán)重受傷后年輕肌肉恢復(fù)：
使用具有柔軟彈性界面的機(jī)器人負(fù)荷裝置對受傷后肢施加循環(huán)壓力。年輕和老年肌肉在嚴(yán)重受傷后1天開始接受每日ML治療。在年輕小鼠中，ML治療14天后顯著提高了受損肌肉的收縮力和速度。這些對肌肉功能的正面療效并沒有隨著年齡的增長而保留。治療21天后，ML治療在老年小鼠的肌肉功能方面沒有作用，肌肉收縮力和速度仍然明顯低于受傷年輕肌肉。
組織學(xué)分析顯示，ML顯著降低了受損年輕肌肉中肌纖維受損的百分比和組織纖維化程度。損傷治療14天后，受傷老化肌肉的纖維化程度顯著高于同期受傷年輕肌肉。這種嚴(yán)重?fù)p傷后的肌肉再生也可能在一定程度上受到周圍神經(jīng)和神經(jīng)肌肉突觸的影響，在年齡背景下就顯得更加重要。恢復(fù)14天后，年輕和老年肌肉的突觸密度沒有觀察到顯著的年齡依賴性。然而，ML治療僅促進(jìn)受傷年輕肌肉的平均突觸密度增加，而不是老化肌肉，這表明該損傷模型中神經(jīng)元突觸形成的潛在機(jī)械敏感性可能隨著年齡的增長而失去。這些發(fā)現(xiàn)揭示了ML對嚴(yán)重?fù)p傷后肌肉再生的重要年齡依賴性影響。
圖 ML治療不能對受傷老化肌肉產(chǎn)生治療效果
ML在恢復(fù)過程中破壞衰老肌肉干細(xì)胞的再生行為：
由于肌肉干細(xì)胞的活化、增殖和分化對于肌肉再生的發(fā)生至關(guān)重要，接下來評估損傷后對ML響應(yīng)的衰老干細(xì)胞行為。ML治療老化肌肉在第7天出現(xiàn)肌肉干細(xì)胞峰值，直到第14天仍然顯著高于對照組，而對照組已經(jīng)趨向基線水平。由于損傷后觀察到的大多數(shù)Pax7細(xì)胞是肌生成的MPC，量化表達(dá)MyoD的Pax7細(xì)胞比例。Pax7/MyoD雙陽性細(xì)胞也在損傷后3天達(dá)到峰值，與ML處理組相比對照組中的Pax7+/MyoD+細(xì)胞在第3天的比例顯著更高，隨后下降得更快。已知成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌細(xì)胞伴隨著肌生成蛋白（MyoG）的表達(dá)，量化表達(dá)MyoG的細(xì)胞數(shù)量。第14天，ML治療肌肉中Pax7+/MyoG+細(xì)胞數(shù)量減少了3.8倍。這些數(shù)據(jù)表明，在接受ML治療的受傷老年肌肉中，Pax7+ MPC轉(zhuǎn)化為終末分化的MyoG肌細(xì)胞存在延遲。
接下來分析肌肉纖維的成熟度。一旦新再生的肌纖維形成，它們就開始重新表達(dá)肌球蛋白重鏈（eMHC）。對照組中表達(dá)eMHC肌纖維的百分比在第3達(dá)到峰值，而ML治療組在第7天觀察到的較晚峰值。到第14天，ML治療組仍然表現(xiàn)出大量活躍再生的eMHC肌纖維。與ML治療的肌肉相比，對照組表現(xiàn)出明顯更多的較大成熟纖維。此外，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)ML治療的肌肉中指示再生肌纖維的中央有核纖維百分比降低。這些數(shù)據(jù)表明，與接受ML治療的肌肉相比，未經(jīng)治療的受傷老年對照肌肉似乎正在經(jīng)歷更有效的再生過程。
圖 ML破壞老年骨骼肌中MPC的再生行為
嚴(yán)重?fù)p傷后，ML對老化和年輕肌肉炎癥的差異調(diào)節(jié)：
前文驗(yàn)證了ML治療受傷年輕肌肉導(dǎo)致?lián)p傷后3天組織中性粒細(xì)胞顯著減少。相比之下，受傷老化肌肉在14天的ML治療中沒有表現(xiàn)出組織中性粒細(xì)胞數(shù)量或動(dòng)力學(xué)的任何變化。此外，總老年免疫細(xì)胞、老年巨噬細(xì)胞或衰老樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量或動(dòng)力學(xué)也沒有變化。巨噬細(xì)胞亞型（M1、M2a和M2c）同樣不受受損老年肌肉ML治療的影響。
接下來檢查廣泛細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。在受傷年輕肌肉中，在14天的ML治療中促進(jìn)了許多促炎標(biāo)志物的下調(diào)。然而，在受傷老年肌肉中觀察到相反的趨勢，其中ML產(chǎn)生促使大多數(shù)細(xì)胞因子的增加。對年輕與老年肌肉中顯著改變因素的基因富集分析顯示，年輕肌肉中顯著減少的標(biāo)志物主要參與通過 CCR 和 CXCR 結(jié)合或細(xì)胞因子產(chǎn)生等機(jī)制驅(qū)動(dòng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，以及介導(dǎo)免疫細(xì)胞趨化性。而在老化的肌肉中，這個(gè)進(jìn)程是截然相反的。與受傷未治療對照相比，接受ML治療的受傷老年肌肉中干擾素-γ，腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，ML通過對肌肉內(nèi)免疫細(xì)胞存在的差異效應(yīng)和對損傷后促炎細(xì)胞因子級聯(lián)的相反作用對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生年齡依賴性影響。
圖 ML治療免疫調(diào)節(jié)基于年齡依賴性
GC與ML聯(lián)合治療可改善老化肌肉的再生結(jié)果：
為了驗(yàn)證ML誘導(dǎo)老化肌肉炎癥干擾再生的假設(shè)，將每日GC給藥與ML相結(jié)合，通過減少損傷組織中幾種炎癥標(biāo)志物的表達(dá)來減輕ML誘導(dǎo)的老年肌肉炎癥。對用ML治療的受傷老年肌肉中上調(diào)至少50%的標(biāo)記物進(jìn)行基因富集分析，揭示了參與免疫細(xì)胞趨化性、促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生和趨化因子活性的關(guān)鍵途徑出現(xiàn)了下調(diào)。將ML與GC結(jié)合治療受傷老年肌肉降低了促炎標(biāo)志物IFN-γ和TNFɑ的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。與對照肌肉相比，僅ML治療組的NF-κB和TNFRSF1b表達(dá)均升高，而ML+GC治療組組的表達(dá)顯著降低。在ML+GC治療14天后，參與血管生成信號傳導(dǎo)的標(biāo)志物顯著減少，這可能部分是由自我調(diào)節(jié)反饋驅(qū)動(dòng)的。ML+GC治療組在14天內(nèi)后肢灌注表現(xiàn)出顯著改善，并且在第7天后肢壞死顯著減少。這些數(shù)據(jù)表明GC療法可以逆轉(zhuǎn)ML治療對損傷后老年肌肉炎癥的負(fù)面影響，特別是通過調(diào)控細(xì)胞因子相關(guān)路徑來防止ML誘導(dǎo)的幾種關(guān)鍵促炎標(biāo)志物的上調(diào)。
圖 GC治療可改善ML誘導(dǎo)的老化肌肉炎癥
進(jìn)一步評估衰老肌肉干細(xì)胞對ML+GC聯(lián)合治療的反應(yīng)。第14天與僅使用ML組相比，ML+GC組的Pax7+ MPC水平顯著降低，Pax7+/ MyoD+細(xì)胞數(shù)量顯著降低。此外，ML+GC組中eMHC的肌纖維百分比也降低。在ML+GC組中出現(xiàn)更大，更成熟的肌纖維的同時(shí)，觀察到主動(dòng)分化肌源性前體的減少和未成熟eMHC肌纖維數(shù)量的減少。用ML+GC治療老年肌肉的炎癥減少，灌注增加，壞死減少和肌源分化改善促使進(jìn)一步評估在GC介導(dǎo)炎癥控制下ML是否可以改善嚴(yán)重?fù)p傷后的衰老肌肉功能。治療7天后，觀察到ML+GC組受傷老化肌肉的收縮力與對照組和ML治療組相比均有顯著改善。到第14天，ML+GC組表現(xiàn)出比所有組更高的平均收縮力和速度。這些發(fā)現(xiàn)指出了老年炎癥反應(yīng)在受傷后老年骨骼肌再生中的抑制作用，以及使用炎癥控制減輕ML對老年肌肉再生的負(fù)面影響的潛在應(yīng)用。
圖 GC介導(dǎo)的炎癥控制下ML治療改善老化肌肉的再生結(jié)果
小結(jié)：
作者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了受傷骨骼肌對機(jī)器人驅(qū)動(dòng)ML響應(yīng)的年齡依賴性差異，并確定通過非侵入性機(jī)械療法再生老年骨骼肌的潛在免疫治療途徑。盡管再生機(jī)器人策略在肌肉修復(fù)方面具有令人興奮的前景，但這里揭示了衰老干細(xì)胞和免疫細(xì)胞對ML響應(yīng)的顯著差異，這為基于機(jī)器人的機(jī)械療法實(shí)現(xiàn)最好地轉(zhuǎn)化提供了見解。與先前在年輕肌肉中的發(fā)現(xiàn)相反，ML治療對衰老肌肉的再生沒有益處，反而會(huì)加劇組織炎癥并擾亂衰老肌肉干細(xì)胞的功能。然而，使用GC治療減少炎癥減輕了ML對老年干細(xì)胞的負(fù)面影響，并使老年肌肉對機(jī)械療法做出反應(yīng)，從而突出了生物學(xué)因素（如年齡）在機(jī)械療法中的重要性。盡管GC治療可能伴有一系列潛在的不良反應(yīng)，但在這項(xiàng)工作中使用GC僅在于提供了概念證明。進(jìn)一步的研究應(yīng)側(cè)重于使用更有針對性的輔助藥物與ML聯(lián)合使用，以及對ML在衰老肌肉中的負(fù)面影響進(jìn)行更深入的評估。老年創(chuàng)傷是一個(gè)可以從機(jī)器人輔助組織再生技術(shù)中受益匪淺的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。這項(xiàng)工作證明了使用藥物控制與年齡相關(guān)的生物變化作為基于機(jī)器人治療輔助手段的重要性。
原文：
S L McNamara,B R Seo, B R Freedman, et al. Anti-inflammatory therapy enables robot-actuated regeneration of aged muscle. Sci Robot. 2023 Mar 22;8(76):eadd9369.
https://www.science.org/doi/10.1126/scirobotics.add9369
