第一作者：劉紅文
通訊作者：張曉兵
通訊單位：湖南大學(xué)、臨沂大學(xué)
核心內(nèi)容：
1. 概述了近十年來(lái)小分子熒光酶探針的最新進(jìn)展。
2. 介紹了小分子熒光酶探針領(lǐng)域所面臨的挑戰(zhàn)和機(jī)遇以及臨床應(yīng)用前景。
據(jù)世衛(wèi)組織估計(jì)，到2035年全世界每年將有2400萬(wàn)新癌癥病例和1450萬(wàn)癌癥相關(guān)死亡案例。在與癌癥相關(guān)的死亡中，如果可以早期診斷出癌癥，約30%的人會(huì)有獲救的希望。因此對(duì)癌癥早期準(zhǔn)確的診斷對(duì)于增加治愈癌癥和提高癌癥存活率的幾率是非常重要的。癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物的臨床檢測(cè)在癌癥診斷和治療方面具有重要意義。
異常的酶活性與癌癥的發(fā)展有直接的關(guān)系，因此在活的癌細(xì)胞中識(shí)別這些酶的位置和表達(dá)水平對(duì)于早期癌癥診斷監(jiān)測(cè)和治療具有相當(dāng)重要的意義。目前，小分子熒光酶探針已成為生物系統(tǒng)中酶活性檢測(cè)和成像的有力工具，其具有較高的靈敏度、無(wú)損快速分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)的能力。由于其結(jié)構(gòu)上的精確性，許多小分子酶熒光探針可以根據(jù)不同的需求而被設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)出來(lái)，例如用于實(shí)時(shí)跟蹤和觀(guān)察活的癌細(xì)胞和活體中的不同種類(lèi)的酶。
有鑒于此，湖南大學(xué)張曉兵教授課題組概述了近年來(lái)小分子酶熒光探針的最新研究進(jìn)展以及挑戰(zhàn)和機(jī)遇。
圖1 基于底物的策略的一般結(jié)構(gòu)機(jī)理示意圖
1. 小分子熒光酶探針的設(shè)計(jì)策略
大多數(shù)小分子酶促熒光探針都是基于與酶的活性位點(diǎn)包括催化位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn))的特異性相互作用而設(shè)計(jì)的。酶具有區(qū)分不同底物之間微小差異和催化底物特異性反應(yīng)的能力。酶抑制劑則是另一種能與高親和力的酶特異性結(jié)合，降低酶活性的分子。根據(jù)探針與酶相互作用的機(jī)理，將小分子熒光酶探針的設(shè)計(jì)策略分為底基策略和非底基策略。
通過(guò)將底物基團(tuán)附著到熒光團(tuán)上產(chǎn)生基于底物的探針，熒光團(tuán)的光譜特性在酶活性變化后發(fā)生改變。在過(guò)去的幾年里，對(duì)底物酶探針進(jìn)行了有效的研究。大多數(shù)的酶探針都是基于這種策略來(lái)檢測(cè)和成像酶的活性。常規(guī)的基于底物的熒光探針特征是由兩個(gè)部分組成:熒光團(tuán)及其相應(yīng)的識(shí)別組。由于連接物與熒光團(tuán)之間的化學(xué)鍵不再局限于酰胺鍵，因此對(duì)于熒光團(tuán)的選擇也得到了改善。此后，許多研究報(bào)道了自毀型連接子在熒光酶探針設(shè)計(jì)中的重要性。
非基于底物的酶探針主要依賴(lài)于酶及其抑制劑或天然配體的高親和力。典型的非基于底物的酶探針一般有三種組分：結(jié)合基團(tuán)以共價(jià)或非共價(jià)方式與酶的活性位點(diǎn)相互作用；防止活性位點(diǎn)周?chē)鸁晒鈭F(tuán)的立體位阻的柔性連接器；以及可視化熒光團(tuán)。
天然配體探針已經(jīng)充分證明了其顯著的優(yōu)勢(shì)，然而只有一小部分酶具有特定的天然肽配體，這也限制了天然配體探針的開(kāi)發(fā)。另外，一個(gè)有效的抑制劑通常對(duì)其目標(biāo)酶具有很高的親和力和特異性。因此，當(dāng)適當(dāng)?shù)囊种苿┡c不和靶標(biāo)相互作用的適當(dāng)熒光團(tuán)連接時(shí)，就可以開(kāi)發(fā)出高效的、特異的抑制探針用于檢測(cè)和成像活癌細(xì)胞中各種酶活性。
圖2 非基于底物的酶探針的策略的一般結(jié)構(gòu)機(jī)理示意圖
圖3 小分子熒光酶探針設(shè)計(jì)的響應(yīng)機(jī)制
2. 小分子熒光酶探針在癌癥成像中的應(yīng)用
基于上述設(shè)計(jì)策略，大量的小分子熒光酶探針被有效地設(shè)計(jì)和構(gòu)建。此外它們還被廣泛應(yīng)用于生物傳感、生物成像以及生物醫(yī)學(xué)診療，包括用于水解酶的小分子熒光探針，其中包括磷酸酶、羧酸酯水解酶、糖苷水解酶、蛋白酶以及一些雙水解酶特異性小分子熒光酶探針。
這些酶大多與癌癥的產(chǎn)生和發(fā)展相關(guān)。例如磷酸酶是一種結(jié)構(gòu)多樣的信號(hào)酶，可以從核酸、蛋白質(zhì)和碳水化合物等不同的基質(zhì)中除去磷酸基。磷酸酶作為調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)通路的重要分子開(kāi)關(guān)，其異常活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致不受控制的增殖、分化、和轉(zhuǎn)移，這些都與許多癌癥有關(guān)；亦或糖基化修飾常常導(dǎo)致癌細(xì)胞中糖蛋白的表達(dá)、代謝、功能、特性、穩(wěn)定性和細(xì)胞定位發(fā)生改變。
因此，異常的糖基化被認(rèn)為是癌癥的一個(gè)標(biāo)志。在原發(fā)性卵巢癌和衰老細(xì)胞中都有報(bào)道發(fā)現(xiàn)β-gal異常聚集，可作為原發(fā)性卵巢癌和衰老的重要生物標(biāo)志物。
圖4 堿性磷酸酶（ALP）小分子探針
圖5 β-gal探針結(jié)構(gòu)
圖6 亮氨酸氨基肽酶探針
另一種是用于氧化還原酶的小分子熒光探針，包括酪氨酸酶、單胺氧化酶、硝基還原酶（NTR）及硫氧還蛋白還原酶等等。酪氨酸酶是一種氧化酶可以控制黑色素生成。該酶主要參與黑素合成的兩種不同反應(yīng)，被認(rèn)為是黑色素瘤癌細(xì)胞的生物標(biāo)志物。此外，酪氨酸酶的異常水平也可能導(dǎo)致白癜風(fēng)和帕金森病；NTR是可以將NADPH為電子源，將硝基芳香族化合物還原為相應(yīng)的胺的一種酶。
在實(shí)體瘤中，NTR水平與缺氧程度直接相關(guān)。因此，NTR水平的檢測(cè)可用于評(píng)估腫瘤的低氧程度。這種酶的還原被廣泛應(yīng)用于設(shè)計(jì)低氧靶向和成像熒光探針。
圖7 用于酪氨酸酶的小分子熒光探針
圖8 NTR探針用于A(yíng)549腫瘤模型小鼠體內(nèi)熒光成像
最后一種是用于轉(zhuǎn)移酶例如γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）的小分子熒光酶探針。GGT是一種細(xì)胞-膜結(jié)合轉(zhuǎn)移酶，能催化γ-谷氨酰基官能團(tuán)從谷胱甘肽（GSH）等分子轉(zhuǎn)移到氨基酸、肽或水等合適的受體，其在谷胱甘肽的合成降解循環(huán)中起著關(guān)鍵作用。由于癌細(xì)胞高度依賴(lài)半胱氨酸，而GGT介導(dǎo)的細(xì)胞外GSH代謝產(chǎn)生半胱氨酸使腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)和生存的優(yōu)勢(shì)。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的GGT水平與一些種類(lèi)的人類(lèi)癌細(xì)胞有關(guān)。有研究表明，GGT可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原代謝促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、侵襲和耐藥。因此，GGT可被視為癌癥的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。由于GGT在生理和病理過(guò)程中的重要作用，因此對(duì)生物樣品中GGT活性的檢測(cè)和成像具有重要意義。
圖9 GGT響應(yīng)的分子探針結(jié)構(gòu)
3. 小分子熒光酶探針用于臨床應(yīng)用
光學(xué)造影劑來(lái)指導(dǎo)腫瘤手術(shù)是小分子熒光酶探針最具吸引力的臨床應(yīng)用之一。對(duì)于癌癥治療的外科干預(yù)，主要的挑戰(zhàn)是在細(xì)胞水平上確定腫瘤和周?chē)】到M織之間的界限。熒光成像技術(shù)是提高腫瘤手術(shù)視覺(jué)效果的一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域。
最近有一些熒光酶探針被用于這個(gè)問(wèn)題。例如第一個(gè)用于臨床應(yīng)用的GGT探針。另外小分子熒光促糖苷酶探針已成功用于腹腔鏡和內(nèi)鏡下檢測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)移。這種轉(zhuǎn)移可以在5分鐘內(nèi)觀(guān)察到，這使得探頭不僅可以在術(shù)前使用，而且在診斷或手術(shù)中遇到可疑病變時(shí)也可以使用。
圖10 有代表性的醫(yī)用熒光酶探針的結(jié)構(gòu)
4. 結(jié)論與展望
在過(guò)去的十年中，小分子酶熒光探針用于癌癥成像的研究取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。小分子熒光探針能夠直接檢測(cè)和成像活癌細(xì)胞中酶的異常水平，為癌癥診斷和研究癌癥發(fā)展及治療過(guò)程中酶的功能提供了強(qiáng)有力的幫助。
然而，盡管取得了如此顯著的進(jìn)展，但在將這些探針從研究轉(zhuǎn)化到更實(shí)際的臨床應(yīng)用仍存在一些挑戰(zhàn)。因?yàn)橥怀龅撵`敏度和選擇性是酶熒光探針的基本要求，而酶熒光探針是準(zhǔn)確檢測(cè)低豐度的酶在癌癥早期診斷中所必需的。因此還需要探索一些更加智能的設(shè)計(jì)策略，以提高新探針的信噪比和靈敏度。
目前小分子酶促熒光探針在腫瘤術(shù)中鑒定的臨床應(yīng)用中顯示出廣闊的應(yīng)用前景。基于酶熒光探針的成像有助于外科醫(yī)生在手術(shù)過(guò)程中準(zhǔn)確觀(guān)察癌癥和正常組織之間的邊界。影像引導(dǎo)的癌癥治療也將為小分子酶促熒光探針的研究提供未來(lái)的發(fā)展方向。最后，將小分子酶促熒光探針從學(xué)術(shù)研究推向臨床的一個(gè)重要挑戰(zhàn)是獲得FDA的批準(zhǔn)。
為此，功能化PET放射標(biāo)標(biāo)記或磁共振成像熒光探針來(lái)制造雙熒光/PET或MRI探針將是一個(gè)有效的方法。酶熒光探針的不斷發(fā)展及其在癌癥細(xì)胞、臨床前動(dòng)物模型甚至人類(lèi)的酶活性成像方面的潛在應(yīng)用，將有助于提高人們對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)和疾病的理解和認(rèn)識(shí)，并最終改善臨床的癌癥診療。
總之，本文綜述了近年來(lái)小分子酶熒光探針用于癌癥成像的研究領(lǐng)域的進(jìn)展，包括小分子熒光探針用于檢測(cè)和成像活癌細(xì)胞中各種酶的設(shè)計(jì)策略和應(yīng)用以及靶向治療，也提出了這一領(lǐng)域未來(lái)走向臨床所面臨的挑戰(zhàn)和應(yīng)對(duì)思路，為研究小分子酶熒光探針提供了全面詳細(xì)的介紹和新的見(jiàn)解。
參考文獻(xiàn)：
Liu H, Chen L, et al. Recent progresses in small-molecule enzymatic fluorescent probes for cancer imaging[J]. Chemical Society Reviews, 2018.
DOI: 10.1039/c7cs00862g
http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2018/cs/c7cs00862g#!divAbstract
