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原創(chuàng)丨彤心未泯（學(xué)研匯 技術(shù)中心）
編輯丨風(fēng)云
熒光顯微鏡具有分子特異性，是生命科學(xué)中用于了解復(fù)雜生物系統(tǒng)的主要表征方法之一。超分辨率方法可以在15至20nm范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分辨率，但單個生物分子之間的相互作用發(fā)生在10nm 以下的長度尺度上，分子內(nèi)結(jié)構(gòu)的表征需要埃級分辨率。最先進(jìn)的超分辨率已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在某些體外條件下空間分辨率低至5 nm和定位精度為1 nm。然而，這樣的分辨率并不能直接轉(zhuǎn)化為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，而埃級分辨率迄今尚未得到證實(shí)。
有鑒于此，德國馬普研究所Ralf Jungmann等人介紹了一種DNA條形碼方法，即通過順序成像(RESI)提高分辨率，使用現(xiàn)成的熒光顯微鏡硬件和試劑將熒光顯微鏡的分辨率提高到埃級。通過以>15 nm 的中等空間分辨率對稀疏目標(biāo)子集進(jìn)行順序成像，證明了完整細(xì)胞中的生物分子可以實(shí)現(xiàn)單蛋白分辨率。通過實(shí)驗(yàn)解決了埃級分辨率的DNA中單個堿基的DNA骨干距離。原理驗(yàn)證演示中使用該方法在未處理和藥物處理的細(xì)胞中原位繪制免疫療法靶標(biāo)CD20的分子排列，這為評估靶向免疫療法的分子機(jī)制提供了可能性。這些觀察表明，通過在環(huán)境條件下對整個完整細(xì)胞進(jìn)行分子內(nèi)成像，RESI縮小了超分辨率顯微鏡和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究之間的差距，從而提供了理解復(fù)雜生物系統(tǒng)的關(guān)鍵信息。
RESI概念
廣角單分子定位顯微鏡 (SMLM)中目標(biāo)分子的定位精度最終和根本上受到每次閃爍事件收集的光子數(shù)量的限制。SMLM無法解析的兩個或多個點(diǎn)會產(chǎn)生重疊的定位分布，從而排除了將定位唯一分配給各個目標(biāo)的可能性。然而，如果每個定位都可以通過顏色、條形碼或任何其他分子身份分配給特定目標(biāo)，則它們可以按目標(biāo)明確分組。作者使用 Exchange-PAINT17針對相同的目標(biāo)分子介紹了這一概念的直接實(shí)現(xiàn)。將此實(shí)施方式稱為通過順序成像(RESI)實(shí)現(xiàn)的分辨率增強(qiáng)，以及由此產(chǎn)生的定位RESI定位。通過在計算機(jī)中應(yīng)用RESI，證明了超分辨率的分辨率改進(jìn)。
圖 RESI概念
RESI 解析單核孔復(fù)合蛋白
為了證明RESI在細(xì)胞環(huán)境中的適用性，接下來對核孔復(fù)合體(NPC)的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行了成像。作者展示了 Nup96 分子（標(biāo)記有單體增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (mEGFP)）的典型衍射極限和DNA-PAINT 圖像，這些分子標(biāo)記有 DNA 偶聯(lián)的抗GFP納米抗體。定位組后續(xù)RESI超定位實(shí)現(xiàn)了定期可視化Nup96蛋白的單個復(fù)制。重建的RESI圖像具有大約1nm的平均橫向定位精度，比單獨(dú)的 DNA-PAINT采集輪次提高了六倍。使用SMLM數(shù)據(jù)無模型方法對1217個 NPC進(jìn)行了無偏3D平均，重現(xiàn)了Nup96 在細(xì)胞質(zhì)和核環(huán)中的八重對稱性以及結(jié)構(gòu)平均值。借助 RESI 前所未有的空間分辨率，解決了大多數(shù) Nup96蛋白質(zhì)對的這種空間排列，這在以前是光學(xué)顯微鏡無法實(shí)現(xiàn)的。
圖 RESI以?ngstr?m精度解析全細(xì)胞中的NPC蛋白
以?ngstr?m分辨率對DNA堿基成像
為了通過RESI分析最終可實(shí)現(xiàn)的空間分辨率，設(shè)計了一個扁平的矩形DNA結(jié)構(gòu)。RESI識別了所有DNA結(jié)構(gòu)中的單鏈位置，在100分鐘的圖像采集時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了這一點(diǎn)。作者測量了單個DNA結(jié)構(gòu)中兩條單鏈之間的距離為8.5 ± 1.7 ?，通過區(qū)分小于一納米的結(jié)構(gòu)，這證明了光學(xué)顯微鏡前所未有的分辨率。為了量化分辨率增益，計算了不同K值下的DNA-PAINT定位的RESI定位，證明了有效定位精度與成比例，對于平均K=254產(chǎn)生的平均定位精度為1.3?。
圖 RESI以?ngstr?m分辨率解析單個DNA堿基對的距離
CD20受體組織
最后，應(yīng)用RESI來研究CD20 膜受體的組織，迄今為止，原生細(xì)胞環(huán)境中的低溫EM和現(xiàn)有的超分辨率技術(shù)都無法解決這個問題。作者應(yīng)用RESI研究瞬時轉(zhuǎn)染mEGFP-CD20的中國倉鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞中CD20的分子排列，使用四輪探針交換總成像時間為4.4小時。在未經(jīng)處理的細(xì)胞的衍射極限概述和 DNA-PAINT 超分辨率圖像中，CD20出現(xiàn)均勻分布，而RTX處理的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的 CD20 簇。為了定量評估未處理細(xì)胞中二聚體的存在，對DNA-PAINT和RESI數(shù)據(jù)進(jìn)行了首次最近鄰距離(NND)分析，證明了兩種情況下的非隨機(jī)分布。最后，通過與數(shù)值模擬進(jìn)行比較，探討了六聚體環(huán)狀排列的存在。實(shí)驗(yàn)檢測到的CD20簇的特征表明不存在孤立的六聚體。
圖 RESI顯示藥物治療后亞納米精度的CD20受體（重組）組織
參考文獻(xiàn)：
Reinhardt, S.C.M., Masullo, L.A., Baudrexel, I. et al. ?ngstr?m-resolution fluorescence microscopy. Nature 617, 711–716 (2023).
DOI: 10.1038/s41586-023-05925-9
https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9
