細(xì)胞球體（例如類器官），彌補(bǔ)了體外系統(tǒng)和體內(nèi)動(dòng)物模型之間的不連續(xù)性，是比模擬人類器官的二維細(xì)胞層更好的體內(nèi)微環(huán)境模型。目前生成球狀體的程序，如不粘性基質(zhì)，是繁瑣的、耗時(shí)的、昂貴的或不好控制的。這些方法都沒有模仿細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）生物發(fā)生的特征，例如調(diào)節(jié)前體分泌和隨后組裝到基質(zhì)中，以形成細(xì)胞間連接。此外，ECM蛋白含有多種翻譯后修飾的酶促反應(yīng)，以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和遷移，如在ECM蛋白的確定位點(diǎn)中，磷酸化的頻率很高。
到目前為止，合成材料要模擬ECM蛋白的動(dòng)態(tài)和瞬時(shí)的磷酸化一直是個(gè)挑戰(zhàn)。由非共價(jià)相互作用形成的肽組合的固有動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)可能提供一個(gè)解決方案，肽組合形成水凝膠基質(zhì)以模仿細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程的ECM的事實(shí)證明了這一點(diǎn)。然而，大多數(shù)水凝膠是在原位制作的，以包圍細(xì)胞，這與組織不同，細(xì)胞圍繞著原位制作的ECM。之前研究已經(jīng)表明，酶反應(yīng)性D-磷酸肽組合誘導(dǎo)HS-5細(xì)胞球狀體，但詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。此外，盡管多肽納米纖維的功能多種多樣，但它們的原子結(jié)構(gòu)在很大程度上仍然是未知的。
鑒于此，布蘭迪斯大學(xué)徐兵、弗吉尼亞大學(xué)Edward H. Egelman、Fengbin Wang等人報(bào)告了酶反應(yīng)性 D-磷酸肽的轉(zhuǎn)胞吞作用（即胞吞作用和胞吐作用）產(chǎn)生細(xì)胞間 D-肽納米纖維作為水凝膠基質(zhì)，使細(xì)胞球體形成。
圖|自組裝 D 肽納米纖維形成細(xì)胞間水凝膠
D-磷酸肽含有熒光的硝基苯甲二唑（NBD）和自組裝的D-苯丙氨酸-D-苯丙氨酸（ff）。NBD報(bào)告了肽在細(xì)胞試驗(yàn)中的組裝形成。由于絲氨酸和酪氨酸經(jīng)常富集在整體膜蛋白的細(xì)胞外域，如用于細(xì)胞間粘附的閉鎖素，研究人員在ff的C端連接了D-絲氨酸（s）和D-磷酸酪氨酸（py）。磷酸酪氨酸使D-肽具有磷酸酶的反應(yīng)性。這種設(shè)計(jì)導(dǎo)致了關(guān)鍵分子，NBD-ffspy（1）。且還研究了具有類似設(shè)計(jì)的NBD-ffspy類似物。
用堿性磷酸酶 (ALP) 處理 NBD–ffspy（高于其臨界膠束濃度）會(huì)產(chǎn)生水凝膠。應(yīng)變掃描顯示 ALP 指導(dǎo)的快速水凝膠化大約 1.5 h，并確認(rèn) NBD-ffsy 組件充當(dāng)凝膠基質(zhì)，與 ALP 快速將 NBD-ffspy 轉(zhuǎn)換為 NBD-ffsy 一致。引入 ALP 后，NBD–ffspy自組裝成納米纖維，并最終在 24 小時(shí)后形成纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)。隨著時(shí)間的推移，束直徑逐漸增加并變得更加分散，這表明 NBD-ffsy 組件是多態(tài)的。使用低溫電子顯微鏡 (cryo-EM)，研究人員確定了負(fù)責(zé)細(xì)胞間凝膠化的 D 肽納米纖維的原子結(jié)構(gòu)。
圖|NBD-ffsy和BP–ffsy在體外自組裝成交叉β絲
HS-5細(xì)胞可以作為檢測(cè) D 肽組裝體形態(tài)發(fā)生效應(yīng)的可靠檢測(cè)方法，因?yàn)樗鼈冊(cè)谡Ｅ囵B(yǎng)條件下保持為單層單個(gè)細(xì)胞，并且在過度匯合時(shí)幾乎不會(huì)形成細(xì)胞團(tuán)塊。在無毒濃度下，NBD–ffspy 會(huì)在粘附和懸浮的 HS-5 細(xì)胞中產(chǎn)生球體，球體內(nèi)組裝體的細(xì)胞外分布。特別是，NBD–ffspy在 12 小時(shí)內(nèi)迅速誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞聚集。球體大小與濃度呈正相關(guān)，與聚-D-賴氨酸培養(yǎng)皿涂層呈負(fù)相關(guān)，表明 NBD-ffspy 促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞粘附超過細(xì)胞-基質(zhì)粘附。
圖|來自粘附和懸浮HS-5細(xì)胞的球體由與纖連蛋白共定位的細(xì)胞間水凝膠組成
受涉及可溶性蛋白質(zhì)二聚體分泌和隨后自組裝成不溶性基質(zhì)的細(xì)胞纖連蛋白合成的啟發(fā)，研究人員研究了轉(zhuǎn)胞吞作用在球狀體形成中的作用。首先使用不同途徑的內(nèi)吞作用抑制劑，發(fā)現(xiàn)氯丙嗪是一種網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用抑制劑，可顯著降低 NBD-ffspy 的細(xì)胞攝取。由于氯丙嗪對(duì) HS-5 細(xì)胞的毒性，研究人員轉(zhuǎn)而使用他莫昔芬誘導(dǎo)的動(dòng)力蛋白三重敲除 (TKO) 小鼠成纖維細(xì)胞來減少內(nèi)吞作用。在驗(yàn)證成功敲除 (~90%) 后，共聚焦圖像顯示每個(gè)細(xì)胞的囊泡數(shù)量減少，同時(shí)球體尺寸減小，表明內(nèi)吞作用在球體形成中的關(guān)鍵作用。
此外，研究人員使用三種類型的胞吐抑制劑來抑制分泌：（1）維拉帕米（Ver）用于抑制鈣依賴性胞吐；(2) brefeldin A (BFA) 用于抑制常規(guī)內(nèi)體運(yùn)輸；(3) vacuolin-1 (V-1) 和蔗糖用于誘導(dǎo)空泡形成，V-1 可防止非常規(guī)內(nèi)溶酶體分泌。以無毒濃度處理 HS-5 細(xì)胞，所有三種抑制劑都會(huì)破壞粘附和懸浮 HS-5 細(xì)胞中的球狀體形成。這證明了這種胞吐機(jī)制在產(chǎn)生球狀體中的必要性。這些結(jié)果支持這樣一個(gè)事實(shí)，即 NBD-ffspy 通過 D 肽絲的轉(zhuǎn)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞間隙來誘導(dǎo)球狀體。
圖|細(xì)胞內(nèi)吞和胞吐對(duì)球體的形成至關(guān)重要
此外，研究人員還研究了D-肽納米纖維對(duì)纖連蛋白（rFN）纖維形成的促進(jìn)作用。使用活細(xì)胞成像技術(shù)觀察了HS-5細(xì)胞與熒光標(biāo)記的rFN和NBD-ffspy的共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，HS-5細(xì)胞能迅速將來自血漿的rFN加工成纖維結(jié)構(gòu)，而NBD-ffspy經(jīng)歷了從點(diǎn)狀到纖維狀的轉(zhuǎn)變，并與rFN逐漸共定位。共定位時(shí)間為24-72小時(shí)，rFN的大小隨著與NBD-ffspy的共定位增加，表明NBD-ffspy促進(jìn)了纖連蛋白的重構(gòu)。共聚焦圖像顯示NBD-ffsy與 rFN 明顯原纖維形成的共定位，支持 NBD-ffsy 納米纖維的 ECM 重塑效應(yīng)。
圖|D肽納米纖維促進(jìn)纖連蛋白的原纖維生成
簡(jiǎn)而言之，研究人員研究了在 HS-5 細(xì)胞的細(xì)胞間隙內(nèi)形成的 D 肽納米纖維的結(jié)構(gòu)和機(jī)制，這些納米纖維在粘附和懸浮條件下迅速形成球狀體。研究結(jié)果表明，自組裝基序、磷酸鹽和納米顆粒到納米纖維的轉(zhuǎn)化對(duì)于球狀體的形成是必不可少的。具有磷酸酪氨酸殘基的 NBD–ffspy 經(jīng)歷轉(zhuǎn)細(xì)胞去磷酸化作用，產(chǎn)生與纖連蛋白共定位的細(xì)胞間組裝體。這些肽組裝促進(jìn)了纖連蛋白的原纖維形成，并作為可逆的細(xì)胞間納米連接將細(xì)胞粘合在一起。通過形成一種適應(yīng)性超分子水凝膠，在納米和微米尺度上重塑內(nèi)源性蛋白質(zhì)并控制反應(yīng)-擴(kuò)散，這項(xiàng)工作說明了整合低溫電子顯微鏡、酶促變形（納米顆粒到納米纖維）和細(xì)胞生物學(xué)（胞吞作用和胞吐作用）來模仿ECM生物生成的潛力?；诟杉?xì)胞分化中的表型轉(zhuǎn)換，這項(xiàng)工作中采用的方法應(yīng)該有助于指導(dǎo)細(xì)胞分化，這是一項(xiàng)正在進(jìn)行的研究的主題。
參考文獻(xiàn)：
Guo, J., Wang, F., Huang, Y. et al. Cell spheroid creation by transcytotic intercellular gelation. Nat. Nanotechnol. (2023).
https://doi.org/10.1038/s41565-023-01401-7
