核酸適配體——短的單鏈 DNA 或 RNA 分子，可以選擇性地以高特異性結合靶標（肽、蛋白質、碳水化合物）——已成為分子識別中抗體的有希望的替代品。適配體擁有獨特的特點，如高穩定性、成本效益高的大規模合成、批次間差異最小、非免疫原性，以及對特定位點的化學修飾的適應性。盡管適配體具有吸引人的特點，但它們在生物傳感中的應用仍然受到限制，主要原因是缺乏適用于各種生物分子目標的高質量適配體。標準的適配體選擇過程 SELEX——通過指數富集對配體進行系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）——由于需要多個循環，因此需要大量人力和時間，并且無法預測或編程生成的適配體的目標親和力 (Kd)。
于此，加拿大多倫多大學Shana O. Kelley院士等人開發了一種稱之為“Pro-SELEX”的改進方法，該方法能夠定量分離具有可編程結合親和力的適配體。在輪次選擇中，該創新方法集粒子展示、磁珠分選、高維平行選擇、高含量生物信息學于一體。成果發表在Nature Chemistry上。
上海交通大學樊春海院士和宋萍等人對該研究成果進行評述。
最近為提高 SELEX 適配體選擇的效率、選擇性和速度所做的努力提供了幾種技術，例如反 SELEX、非 SELEX、M-SELEX 和CE-SELEX，但這些方法仍然需要多個選擇周期。其他方法包括適配體促進生物標志物發現，它使用適配體作為探針來識別和驗證新的生物標志物；以及高通量測序方法，可以并行分析數千到數百萬個適配體序列。然而，這些方法都不能定量生成具有明確結合親和力的適配體。
該研究團隊展示了具有可定制結合親和力的適配體的可編程選擇。使用乳液 PCR 將每個適配子候選物轉化為適配子顆粒，這樣每個顆粒在其表面上攜帶多個拷貝的單個核酸序列。這些顆粒與不同濃度的生物素化結合靶標一起孵育。靶點與這些適配體顆粒的結合水平取決于靶點濃度和它所包被的適配體的結合親和力。通過用抗生物素磁性納米顆粒（其數量與結合的分析物分子的數量相關）標記適配體顆粒，然后可以根據它們的磁性含量將這些顆粒分類到微流體芯片隔室中。
研究人員設計的 Pro-SELEX 芯片包含四個捕獲區，每個捕獲區都有不同的線速度，允許根據不同的磁性水平對粒子進行分類。第一個區域（與更高的目標結合親和力相關）顯示出最高的線速度，由于磁力超過了流速增加帶來的拖曳力，因此保留了具有高磁性含量的顆粒。他們設計的芯片能夠根據粒子的磁性含量（即它們的目標結合親和力）對粒子進行分類。適配體池是從四個隔室中的每一個中收集的材料創建的，并進行了測序。比較生物信息學用于分析單個適配體的展示，驗證真陽性命中并推斷相對親和力范圍。
圖|Pro SELEX能夠選擇具有不同結合親和力的適配體
該團隊將Pro-SELEX應用于適配體選擇，使用人髓過氧化物酶（MPO）作為模型結合靶標。首先，他們預先富集了一個隨機 DNA 文庫，然后通過乳液PCR制備適配體粒子文庫。然后在五個濃度的人髓過氧化物酶上對文庫進行測試，以分離在不同范圍內具有特異性結合親和力的適配體。Pro-SELEX 芯片對文庫進行分選僅需20分鐘即可分選出5 × 107個適配體顆粒，這比基于熒光激活細胞分選的方法更快。對收集到的顆粒進行高通量測序，并開發了一種稱為 AptaZ 的評分工具來分析富集并生成 Z 分數，即每個候選適配體的富集倍數。選擇具有不同 Z 分數的八個候選適配體進行表征，顯示出對人髓過氧化物酶的親和力，Kd 值范圍為 227 pM 至 27.8 nM。Kd 值和 Z 分數之間的線性關系表明可以使用 Z 分數來識別具有所需結合親和力的候選適配體。
基于觀察到的Kd值和 Z 分數之間的相關性，研究人員為經過驗證的人髓過氧化物酶適配體生成了一個搜索帶。設定了所需的Kd值及其理論 Z 分數范圍，并選擇了該范圍內的候選適配體并檢查了結合親和力。“非常適合”被定義為實驗Kd值與所需Kd值之間的差異小于 25%。識別“非常適合”的成功率為20-50%，這表明在 Z 分數范圍內測試多達五個適配體候選物可以識別出具有所需結合親和力的候選物。選定的適配體在常見血清蛋白中表現出對人髓過氧化物酶的優異特異性，突出了它們在分析生物樣品中的潛在用途。
圖|基于Z評分的具有所需親和力的抗MPO適配體的定量分離
這種適配體選擇技術的發展代表了分子識別領域的重大進步。實現的具有選擇親和力的適配體的可編程分選擴展了潛在的應用。高親和力適配體適用于快速靈敏的即時應用，而低親和力適配體由于其結合和解離速度快，因此適用于實時監測。具有可編程親和力的適配體不僅適用于小目標，而且適用于病毒和細菌。例如病毒中和適配體。適配體選擇方法也可以直接在生物樣本中執行，無需進一步優化即可生產可穿戴和治療用途的適配體。
圖|Pro SELEX與當前適配體選擇技術的比較
然而，使用這種方法選擇Kd值低于 10 pM 的高親和力適配體以進行高靈敏度檢測，而不是低親和力適配體仍然是一個挑戰。潛在的解決方案包括使用更大的初始適配體候選池和高親和力適配體的重選策略。此外，摻入非天然核苷酸可以增強結合并擴大目標范圍。隨著研究人員在適配體選擇中探索 Pro-SELEX，適配體驅動的創新在化學、醫學和環境科學中的應用將得到擴展。
參考文獻：
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