新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）已導致全球健康危機，迄今為止已造成超過 600 萬人死亡。疫苗已被證明可以有效降低這種傳染病的發病率和死亡率。目前，多種疫苗模式，包括信使RNA (mRNA)疫苗、表達抗原的腺病毒、滅活病毒和亞單位疫苗，已獲批準或正在臨床開發中。在不同的平臺中，mRNA疫苗不僅表現出優異的能力，能夠引發針對多種SARS-CoV-2變體的中和抗體（NAb）和T細胞反應，而且生產成本低，開發和制造時間短。盡管 mRNA 于 1961 年被發現，但由于其易被酶降解、體內遞送效率低以及先天免疫原性高，其在疫苗開發中的應用一直受到阻礙。通過將 mRNA 納入遞送系統，可以保護其免遭降解并護送其穿過各種生物屏障，從而克服了前兩個挑戰。值得注意的是，由可電離脂質（或類脂質）、磷脂、聚乙二醇化脂質和膽固醇組成的四組分脂質納米粒子（LNP）是臨床上最先進的mRNA遞送平臺，輝瑞/BioNTech的BNT162b2和Moderna的mRNA-1273疫苗就是例證。最后一個挑戰是通過將天然存在的核苷（例如 1-甲基假尿苷 (m1ψ)）摻入體外轉錄的 mRNA 序列以避免其被模式識別受體識別來解決。盡管其耐受性和翻譯能力有所提高，但核苷修飾的 mRNA 的使用在很大程度上損害了先天免疫反應，并削弱了樹突狀細胞（DC，mRNA-LNP 疫苗的主要受體細胞）的激活，而這一過程對建立對疫苗接種的強大適應性免疫力至關重要。有趣的是，先前研究人員發現某些 LNP 具有內在的佐劑活性，可以促進 mRNA 和亞單位疫苗誘導細胞和體液免疫反應。然而，LNP 的佐劑作用根據所使用的類脂質而變化，并且通常較弱且非特異性。Toll樣受體激動劑（TLRas）是一種有效的佐劑，可激活DC呈遞抗原，表達共刺激分子，并產生選擇性細胞因子（例如，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）），有效刺激從先天免疫向適應性免疫的轉變。幾種具有高特異性的小分子 TLRas 已被批準用于免疫調節，包括基于咪唑喹啉的 TLR7/8 激動劑（例如咪喹莫特）。已證明將脂肪酸修飾的 TLRas 摻入負載抗原的脂質體或 NP 中可以增強適應性免疫反應的強度和持續時間。研究人員假設，由于輔助佐劑特性，將合理設計的 TLRa 衍生的可電離類脂質配制到 LNP 中可以進一步增強 mRNA-LNP 疫苗的免疫原性。鑒于此，賓夕法尼亞大學Michael J. Mitchell、Drew Weissman等人基于 TLR7/8 激動劑化學合成了一種 LNP 成分（一種類脂佐劑）。與之前的研究不同，TLRa通常通過酰化與大分子（例如脂質、肽和聚合物）綴合，研究人員在含胺的TLRa和環氧化物烷基之間進行開環反應，產生含有叔胺的可電離脂質，該脂質可以與帶負電荷的信使核糖核酸復合并將其輸送到細胞中。研究人員優化了這種佐劑類脂摻入的 SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗的配方，并系統地評估了其先天性和適應性免疫反應圖 類脂質替代佐劑 SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗及其擬議的引發有效適應性免疫的作用機制C12-TLRa是一種合成的類脂質化合物，源自 TLR7/8 激動劑和 C12 環氧化物。其結構得以證實，計算分析表明其與 TLR7 受體相容。C12-TLRa 表現出可預測的 TLR7 激動活性，但不如同類激動劑有效。它與其他脂質和 mRNA 一起配制為脂質納米顆粒 (LNP)，有效封裝 mRNA。由此產生的 C12-TLRa LNP 在樹突狀細胞中證明了劑量依賴性 mRNA 轉染。與其他多胺衍生的類脂質相比，C12-TLRa 被發現具有較低的轉染能力。為了增強 mRNA 疫苗中的抗原表達，C12-113 LNP 中的可電離類脂質被 C12-TLRa 部分替換，以添加 TLR7/8 激動特性而不影響 mRNA 遞送。配制并測試了各種C12-113/TLRa LNP，5% C12-TLRa取代實現了最高的 mRNA 轉染效率。與 C12-113 LNP 不同，C12-113/TLRa LNP 顯示劑量依賴性 TLR7 激動活性并刺激 TNF-α 產生。使用不同類脂質的其他 LNP 也獲得了類似的結果。理化表征揭示了 C12-113/TLRa LNP 的穩定性和均勻結構，與 C12-113 LNP 相當。與 C12-113 LNP相比，C12-113/TLRa LNP 在各種細胞類型中表現出優異的 mRNA 轉染效率，且無細胞毒性。C12-TLRa的摻入改善了 LNP 的內體逃逸，從而增強了 mRNA 的遞送。C12-TLRa 和內體 TLR7/8 之間的強親和力可能增強了 LNP 和內體膜之間的相互作用。此外，與 C12-113 LNP 相比，C12-113/TLRa LNP 誘導樹突狀細胞更加成熟，并增加促炎細胞因子的分泌。這些發現表明，C12-TLRa 取代顯著增強了 LNP 的佐劑特性和樹突狀細胞的激活。圖 佐劑類脂質取代的 LNP 介導的體外 mRNA 遞送和 DC 激活體內實驗表明，與C12-113 LNP相比，C12-113/TLRa LNP在注射部位和腹股溝淋巴結獲得了更高的mRNA轉染效率。兩種 LNP 在主要器官中均表現出有限的分布和轉染，其中 C12-113/TLRa LNP 在腹股溝淋巴結中觀察到更強的轉染。C12-113/TLRa LNP 增強的 mRNA 表達隨著時間的推移是持久且一致的。此外，C12-113/TLRa LNP 促進樹突狀細胞進一步成熟，并在淋巴結中引發更高、更持久的細胞因子反應，而沒有明顯的全身分布或炎癥。這些發現表明，在SARS-CoV-2 mRNA-LNP疫苗接種的情況下，C12 TLRa取代顯著增強 mRNA 表達和局部先天免疫反應，而不會引起全身毒性。佐劑類脂質取代的 LNP 介導的體內 mRNA 遞送和先天免疫反應進一步檢查了原始和類脂替代佐劑 SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗產生的適應性免疫反應。小鼠使用初免-加強策略接受了兩次疫苗接種，沒有觀察到不良反應。加強劑量后兩周，收集脾臟并分析抗原特異性 CD4+和 CD8+ T 細胞。兩種 LNP 都能誘導表達Th1細胞因子的RBD 特異性 CD4+ T 細胞，但C12-113/TLRa LNP 引發的反應明顯更高。兩種疫苗制劑均不能誘導表達 Th2 細胞因子的 CD4+ T 細胞。C12-113/TLRa LNP 還誘導更多表達 Th1 細胞因子和細胞毒性標記物的 RBD 特異性 CD8+ T 細胞。此外，與 C12-113 LNP 相比，C12-113/TLRa LNP 引發了更高比例的多功能CD4+和 CD8+ T 細胞，表明免疫反應更強。這些雙陽性細胞的細胞因子分泌模式在CD4+和 CD8+ T 細胞之間有所不同，反映了它們各自的輔助和細胞毒活性。圖 由佐劑類脂替代的 SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗誘導的細胞免疫反應分析了 SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗誘導的體液免疫反應。兩種疫苗均引發高水平的RBD 特異性 IgG 抗體，但 C12-113/TLRa LNP 的滴度明顯更高。與 C12-113 LNP 相比，C12-113/TLRa LNP 還引發了更高水平的 IgG2c 抗體，表明更強的Th1 偏向免疫反應。就中和抗體 (NAb) 水平而言，C12-113/TLRa LNP 針對不同的 SARS-CoV-2 變體產生了更多的NAb。此外，與 C12-113 LNP 相比，C12-113/TLRa LNP 疫苗接種更大程度地增加了 RBD 特異性記憶 B 細胞和骨髓駐留長壽命漿細胞 (LLPC) 的數量。這些發現表明，類脂質替代的 mRNA-LNP 佐劑疫苗可誘導更強的體液免疫反應和 LLPC 生成。
圖 由佐劑類脂替代的 SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗誘導的體液免疫反應該研究調查了佐劑類脂質替代對臨床相關 mRNA-LNP 疫苗的影響。對 SM-102 LNP 和 SM-102/TLRa LNP 配方進行了比較。結果表明，與 SM-102 LNP 相比，SM-102/TLRa LNP 實現了更大的 mRNA 轉染，并引發了表達 Th1 細胞因子的 RBD 特異性CD4+和 CD8+ T 細胞比例明顯更高。SM-102/TLRa LNP還誘導更多的 RBD 特異性細胞毒性 CD8+T 細胞以及更高比例的多功能CD4+和CD8+ T 細胞。在體液免疫反應方面，SM-102/TLRa LNP 產生了更高水平的抗 RBD IgG 抗體和針對不同 SARS-CoV-2 變體的更多中和抗體。此外，SM-102/TLRa LNP 誘導了更多 RBD 特異性記憶 B 細胞，具有快速分化為抗體分泌細胞的潛力。這些發現表明，佐劑類脂質替代增強了臨床相關 mRNA-LNP 疫苗的免疫原性，表明了其轉化潛力。研究人員開發了一種可電離的類脂質——一種佐劑類脂質——它不僅作為 LNP 的結構成分來增強 mRNA 的遞送，而且還作為功能部分來增加 LNP 的佐劑作用。佐劑類脂替代的 SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗顯著增強淋巴內 DC 激活和結內促炎細胞因子的產生，由于其在注射部位和引流淋巴結的獨特分布和轉染，在小鼠中具有良好的耐受性。由于先天免疫的改善，使用類脂替代mRNA-LNP佐劑疫苗免疫后，建立了更有效的針對SARS-CoV-2的適應性免疫，包括強烈的Th1偏向細胞免疫反應、抗體反應、B細胞反應和LLPC反應 。此外，研究人員證實佐劑類脂替代可以增強臨床相關 mRNA-LNP 疫苗的免疫原性。該研究為引入類脂質佐劑以提高 mRNA 疫苗適應性免疫反應的質量和程度提供了 LNP 配方基礎。Han, X., Alameh, MG., Butowska, K. et al. Adjuvant lipidoid-substituted lipid nanoparticles augment the immunogenicity of SARS-CoV-2 mRNA vaccines. Nat. Nanotechnol. (2023).https://doi.org/10.1038/s41565-023-01404-4
