Nature Nanotechnology：小小納米孔，大大的能力！
小奇
奇物論
2023-10-16
血清生物標志物對于診斷疾病、監(jiān)測治療效果和預測患者預后至關(guān)重要。傳統(tǒng)上，血液檢測的重點是檢測指示疾病的特定蛋白質(zhì)，最近，還使用了檢測 microRNA (miRNA) 和與病理相關(guān)的小分子的方法。盡管取得了重要進展，檢測方法仍然受到特異性有限、測定時間和成本限制、樣本量要求大和生物標志物覆蓋不完整的困擾。鑒于生物分子在疾病過程中復雜的相互作用，從單一生物標志物檢測到分析物多重檢測的轉(zhuǎn)變已經(jīng)獲得動力，希望為疾病提供更全面的病理生理學見解。對于能夠同時檢測復雜生物液體中的多種生物標志物以改善醫(yī)療保健并實現(xiàn)即時診斷的分析方法的需求尚未得到滿足。由于生物標記物的性質(zhì)多種多樣，從蛋白質(zhì)和肽到小分子和 miRNA，這項任務(wù)提出了巨大的挑戰(zhàn)。一個能夠檢測整個分子陣列的單一平臺將標志著該領(lǐng)域的關(guān)鍵發(fā)展。帝國理工學院Joshua B. Edel、Aleksandar P. Ivanov等人開發(fā)了一種檢測平臺，將納米孔測序與DNA條形碼分子探針相結(jié)合，用于多重檢測分析物，包括蛋白質(zhì)、小分子和 miRNA。研究人員設(shè)計的檢測策略利用納米孔測序、DNA 條形碼分子探針和適體技術(shù)，以多重形式準確檢測多種生物標志物。在納米孔測序中，單個DNA分子首先在施加的電勢下進入孔，然后通過解旋酶馬達逐個堿基地通過孔。在此過程中，流經(jīng)孔的離子電流取決于流經(jīng)孔的堿基序列，從而產(chǎn)生電流與時間的信號。為了針對特定的生物標志物，研究人員設(shè)計了由三個關(guān)鍵區(qū)域組成的 DNA 探針：接頭、目標結(jié)合區(qū)域和條形碼。適配器區(qū)域在探針之間是通用的，并且包含在測序過程中通過孔饋送探針時控制探針易位速度的運動蛋白。靶標結(jié)合區(qū)域?qū)τ诒粶y分析物是特異性的：它要么是結(jié)合miRNA或DNA的互補序列，要么是選擇性結(jié)合特定蛋白質(zhì)或小分子的適體序列。在測序過程中，在解旋酶馬達沿著鏈前進時，當它遇到探針區(qū)域提供的結(jié)構(gòu)屏障時，它會經(jīng)歷暫時的停頓，但僅當該區(qū)域與其目標分子結(jié)合時。與來自不受該結(jié)構(gòu)障礙物約束的探針的信號相比，這種遭遇導致電信號的延遲或停滯。電信號的這種明顯延遲表明目標分子存在于鏈上。此外，通過區(qū)分顯示這些信號延遲的測序事件和不顯示這些信號延遲的測序事件，還可以確定樣品中分析物的濃度。這是通過計算已延遲的讀取比例來實現(xiàn)的。最后，每個探針中都包含一個獨特的條形碼區(qū)域，使分析物的多重檢測成為可能。在測序過程中，適配器區(qū)域首先進入孔，然后是條形碼區(qū)域，其序列可以被堿基調(diào)用以識別每個特定探針及其相關(guān)的目標分析物。為了展示該平臺，研究人員成功檢測了 miRNA、蛋白質(zhì)和小分子，例如與心血管疾病相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)。他們首先通過設(shè)計40個條形碼探針并將它們與每個miRNA靶標單獨孵育來演示序列特異性miRNA檢測。對于研究的每個 miRNA 靶標，當測序過程中存在靶標時，觀察到延遲信號的百分比顯著增加，而沒有觀察到條形碼序列的影響。為了展示整合條形碼如何實現(xiàn)多個目標的多重檢測，將40個條形碼探針與不同濃度的40個miRNA 目標一起孵育，然后進行測序。使用比對協(xié)議，信號被解復用并按條形碼序列分組。使用為每個探針構(gòu)建的濃度百分比延遲曲線，可以在所有分析物的實際濃度的一個數(shù)量級內(nèi)確定40個測試miRNA中的每一個的濃度。圖|使用條形碼探針和納米孔測序?qū)?0種miRNA、蛋白質(zhì)和小分子進行分離除了檢測同一分子物種的多種分析物外，DNA條形碼分子探針與納米孔測序相結(jié)合的多功能性使同時檢測多種分析物成為可能。研究人員證明，使用他們的平臺在單個實驗中檢測miRNA、蛋白質(zhì)和小分子的組合是可能的。在結(jié)合各種分析物類別的雙鏈和三鏈實驗中，與不添加靶分子的對照實驗相比，觀察到miRNA、蛋白質(zhì)和小分子靶標的每個條形碼探針的延遲事件百分比顯著增加。在適應(yīng)性平臺內(nèi)檢測和量化單分子水平上多種生物標志物的能力對于診斷應(yīng)用具有重要意義。在現(xiàn)有的血液生物標志物檢測分析中，提取和擴增步驟的需要可能會增加測試時間（導致樣本損失，例如在 miRNA 快速降解的情況下）并給測量帶來偏差。該研究開發(fā)的平臺可以直接從人血清中進行生物標志物檢測，無需提取或擴增步驟。然而，蛋白質(zhì)需要過濾步驟以防止大蛋白質(zhì)堵塞孔。未來的工作需要確定區(qū)分相似 miRNA 序列的限制，降低假陰性率，并探索靶標結(jié)合區(qū)域的選擇性，以擴大可檢測的生物標志物的數(shù)量。Koch, C., Reilly-O’Donnell, B., Gutierrez, R. et al. Nanopore sequencing of DNA-barcoded probes for highly multiplexed detection of microRNA, proteins and small biomarkers. Nat. Nanotechnol. (2023).https://doi.org/10.1038/s41565-023-01479-z
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