癌細胞的代謝適應以滿足增殖、腫瘤生長和轉移所需的能量、生物合成和抗氧化劑的需求增加。然而，這種代謝重編程是否會影響免疫細胞對癌細胞的識別和消除尚未得到很好的研究。適應性免疫系統由細胞組成，這些細胞通過稱為抗原呈遞的過程識別和響應各種外部刺激。在腫瘤發展的早期階段，細胞毒性免疫細胞（如CD8 T細胞）識別并消除免疫原性癌細胞，防止腫瘤生長和轉移。然而，隨著它們的進展，腫瘤通常會獲得使它們逃避免疫檢測的特性。免疫細胞的代謝是其功能的重要決定因素，但是癌細胞中的代謝是否會影響它們的免疫原性一直是一個懸而未決的問題。
近日，美國索爾克生物研究所的Susan M Kaech與Gerald S Shadel教授合作報道了線粒體電子傳遞鏈在腫瘤生長與免疫反應中的作用。作者團隊證明了電子傳遞鏈（ETC）中的復合體Ⅱ（CⅡ）的缺失，而不是復合體Ⅰ（CⅠ）缺失，會導致腫瘤抗原呈遞與T細胞介導的抗腫瘤作用增強。
這種生物學效應主要是由琥珀酸介導的主要組織相容性復合體-抗原處理和呈遞（MHC-APP）基因的轉錄和表觀遺傳學激活驅動的。此外，通過敲除甲基化控制的J蛋白（MCJ）使得電子優先通過CⅠ，這促使了ETC重構并實現抗腫瘤反應，同時不會誘導非癌細胞線粒體呼吸總體減少相關的副作用。這些發現表明，靶向線粒體代謝可能是癌癥免疫治療的有效方法，以增強免疫檢查點抑制劑的作用。
圖 文章整體思路
降低線粒體CII活性增強抗腫瘤免疫反應：
為了研究CI和CII對腫瘤生長和抗腫瘤免疫反應的貢獻，作者團隊調試了等基因CI（sgNdufa1）或CII（sgSdha或sgSdhc）敲除的YUMM1.7（BrafV600E/Pten?/?/Cdkn2a?/?）小鼠黑色素瘤細胞，并將其植入具有免疫能力的小鼠中。敲除CI或CII亞基如預期的那樣減少了各自的復合物，但不影響其他ETC復合物的豐度度。CI或CII的喪失也顯著降低了氧氣消耗、備用呼吸能力和細胞增殖。出乎意料的是，CI和CII敲除對腫瘤生長有顯著的不同影響。盡管與CII敲除和對照細胞相比，體外增殖較慢，但CI敲除腫瘤在體內沒有表現出任何生長缺陷，這表明YUMM1.7腫瘤生長不需要CI。CII敲除腫瘤的流式細胞術分析顯示，與對照和CI敲除腫瘤相比，免疫細胞（CD45+）浸潤顯著增加，尤其是CD8+T細胞。CD4+T細胞的數量或調節性T細胞（Tregs）的百分比沒有觀察到顯著變化。與此一致，來自CII敲除腫瘤的CD8+T細胞產生更多的干擾素-γ和顆粒酶-B，這表明顯著的腫瘤殺傷效應功能是觀察到的抗腫瘤活性的原因。
由于主要組織相容性復合體I類（MHC-I）的抗原呈遞是T細胞活化和殺傷的主要決定因素，接下來測量了MHC-I在CI和CII缺陷腫瘤細胞上的表達。與CI敲除和對照腫瘤細胞相比，CII敲除腫瘤細胞上的MHC-I表達顯著更高。此外，通過敲除CII敲除細胞中的β2-微球蛋白來抑制抗原呈遞，證實了腫瘤抗原呈遞是CII耗竭的抗腫瘤作用所必需的。與這些數據一致，泛癌數據集的CIBERSORT相關性分析顯示，CII基因（SDHA、SDHB、SDHC和SDHD）的表達與多種癌癥類型的細胞毒性T細胞基因特征呈負相關。因此，CII的缺失，而不是CI的缺失，通過增加抗原呈遞，導致強烈的抗腫瘤T細胞反應。
但是似乎與上述的發現相反的是，CII功能的喪失（即SDHx亞基基因突變）可能在人類中致癌。CII缺乏和琥珀酸鹽積累將從一開始就存在，并可能促進腫瘤發生的早期事件。上文論證CII的耗竭通過增強抗原呈遞來減少腫瘤生長；因此，這種作用很可能不是對腫瘤起始的影響，而是對免疫系統攻擊引起的腫瘤生長的影響。除非存在其他致癌條件，否則小鼠模型中CII的缺失不會導致自發的腫瘤形成。此外，遺傳的致癌CII突變通常會影響特定生理環境中的神經內分泌組織，當CII活性受到抑制和/或與其他致癌基因改變結合時，可以促進特定的腫瘤微環境，這些微環境是有條件致瘤的。
圖 線粒體CII抑制通過增加MHC-I增強抗腫瘤免疫力
線粒體琥珀酸增加腫瘤抗原呈遞：
接下來探索腫瘤細胞抗原呈遞增加的分子機制。首先確定的是CII缺失增加了體外YUMM1.7細胞中MHC-I的細胞表面表達。抑制CII，而不是抑制CI，增加了YUMM1.7細胞中幾個主要組織相容性復合體-抗原處理和呈遞（MHC-APP）基因的轉錄。3-NPA處理的4T1小鼠癌癥細胞獲得了類似的結果。基因表達譜分析顯示，CII抑制的細胞顯示出IFN反應途徑的顯著富集，包括APP基因。IFN-γ誘導的MHC-I上調在Ifngr1和Stat1敲除細胞中被消除，但CII抑制仍然導致這些細胞中表面MHC-I的誘導和APP基因的表達。類似地，CII抑制沒有誘導STAT1的Y701磷酸化。接下來測試CII抑制誘導的MHC-APP基因是否需要NLRC5或IRF1——這兩種已知的轉錄激活因子。NLRC5的缺失，而不是IRF1的缺失，減弱了CII抑制誘導的細胞表面MHC-I和MHC-APP基因的表達。這些發現表明CII抑制誘導MHC-APP基因表達，不需要IFN信號傳導但仍部分依賴于NLRC5。
CII是琥珀酸脫氫酶，而琥珀酸鹽影響核基因表達，那么CII抑制是否通過促進琥珀酸鹽積累來驅動MHC-APP基因表達。CII抑制的細胞具有高水平的琥珀酸累積。同時用細胞可滲透的琥珀酸鹽處理野生型細胞會促進細胞表面MHC-I和MHC-APP基因的表達。由于谷氨酰胺是CII抑制細胞中琥珀酸鹽的主要來源，谷氨酰胺饑餓顯著減少了3-NPA誘導的琥珀酸鹽積累以及細胞表面MHC-I和MHC-APP基因的伴隨表達。最后，在CII敲除細胞中敲除2-氧戊二酸脫氫酶的亞基顯著降低了琥珀酸水平和MHC-I表達。與此相一致，在CCLE中，CII（尤其是SDHC）和MHC-APP編碼基因的表達之間確定了反相關性。此外，對來自腫瘤測序研究的人類乳腺和皮膚癌癥樣本的分析確定了高SDHC表達樣本中MHC-APP基因的顯著下調。因此，線粒體CII抑制可以通過琥珀酸鹽的積累上調MHC-APP，而不依賴于IFN信號傳導，這具有治療意義。
圖 在CII抑制時，線粒體琥珀酸酯驅動MHC-I上調
線粒體琥珀酸通過調節腫瘤表觀遺傳學促進MHC-APP表達：
由于細胞內α-酮戊二酸（αKG）/琥珀酸酯比率是2-OGDD酶活性的重要決定因素，那么CII的抑制是否會降低αKG/琥珀酸酯比例，從而降低2-OGDD活性。抑制CII或向YUMM1.7細胞添加細胞可滲透的琥珀酸鹽顯著降低了細胞內αKG/琥珀酸鹽比率，并增加了組蛋白H3的幾個關鍵賴氨酸殘基的三甲基化，這些殘基通常與轉錄調控有關。CII抑制細胞在細胞滲透性αKG處理增加了αKG/琥珀酸鹽比率后，并逆轉了H3三甲基化、細胞表面MHC-I和MHC-APP基因的表達，與琥珀酸鹽介導的2-OGDD的抑制一致，2-OGDD是CII抑制的關鍵下游效應分子。但是，用5-氮雜胞苷（DNA甲基轉移酶抑制劑）處理CII抑制細胞并沒有阻止MHC-I表達的增加，而是進一步增加了MHC-I的表達，因此琥珀酸鹽對TET DNA去甲基化酶活性的抑制可能不是CII抑制介導的MHC-APP表達的主要因素。
組蛋白甲基化的狀態由KDM和組蛋白甲基轉移酶的相對活性決定，琥珀酸鹽介導的KDMs抑制使平衡向組蛋白甲基化增加轉變。與CII抑制相比，KDM5-C70對KDM5家族（H3K4me3去甲基化酶）的抑制增加了MHC-I的表達，并伴隨著H3K4me3水平的增加。接下來，在CII敲除細胞中對H3K4me3、H3K36me3和H3K27me3特異性的組蛋白甲基轉移酶進行敲除，以恢復各自的組蛋白甲酯化。盡管敲低這些不會影響IFN-γ誘導的MHC-I的增加，但敲低KMT2A和SETD2逆轉了琥珀酸增加對表面MHC-I和MHC-APP基因表達的影響。因此，H3K4me3和H3K36me3是調節抗原呈遞以響應琥珀酸積累的關鍵分子。
為了評估CII抑制對全局表觀遺傳重編程的影響，在用3-NPA、3-NPA和αKG（與琥珀酸競爭）或二甲基亞砜（DMSO）作為載體對照處理的YUMM1.7細胞中對H3K4me3和H3K36me3進行了染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）。正如預期的那樣，在CII抑制后，H3K4me3和H3K36me3信號表現出全基因組增益，這通過補充αKG而顯著逆轉。值得注意的是，幾個MHC-APP基因顯著富集H3K4me3和H3K36me3。例如，在Nlrc5、Psmb9、Tap1和Psmb8的啟動子區域中，H3K4me3水平顯著增加，并且這通過αKG處理顯著逆轉。基于轉錄因子和表觀遺傳學結果，提出一個琥珀酸鹽激活MHC-APP轉錄的模型。CII抑制導致下游的琥珀酸積累，通過抑制KDM4和KDM5組蛋白去甲基化酶活性與增加NLRC5水平，實現協同誘導MHC-APP基因轉錄增加。
圖 線粒體琥珀酸影響組蛋白甲基化調節抗原呈遞
增加線粒體CI相對電子流量可增強腫瘤免疫原性和TCR多樣性：
先前的研究已經證明琥珀酸對巨噬細胞和T細胞的促炎作用。上述研究還表明，琥珀酸鹽在腫瘤細胞內的積累是通過增加抗原呈遞來激活T細胞介導的殺傷。然而，全身抑制CII可能不是提高腫瘤琥珀酸水平的可行方法，因為它可以引發新的腫瘤發生，具有神經毒性，并且由于線粒體ETC活性和ATP產生減少很可能會對正常細胞和組織產生其他不利的生理影響。然而，增加CI驅動的電子流可能會競爭性抑制CII活性，以促使琥珀酸鹽積累而不會顯著降低總ETC活性和ATP產生。甲基化控制的J蛋白（MCJ）是線粒體內膜中的一種內源性CI相互作用蛋白，其敲除導致CI活性高于CII并與CIII形成超復合物。因此，假設通過敲除MCJ來重排ETC以降低CII活性，并促進MHC-APP的表達和抗腫瘤免疫。
在YUMM1.7細胞中敲除MCJ增加了CI+CIII活性，同時CII+CIII活性降低，導致細胞內琥珀酸鹽、抗原呈遞和MHC-APP基因表達水平增加。對Mcj KO細胞中代表性MHC-APP基因啟動子qPCR證實了H3K4me3富集增加，類似于直接CII抑制。與對照腫瘤相比，Mcj-KO腫瘤在小鼠體內生長明顯較慢，保持高水平的MHC-I并有更多的CD45+免疫細胞，尤其是CD8+T細胞浸潤。在免疫原性更強的小鼠黑色素瘤腫瘤模型中觀察到類似的結果。來自對照腫瘤的浸潤性CD8+T細胞表達活化標記CD44和CD69以及TCF-1轉錄因子，而Mcj-KO腫瘤中的表達更大量的PD-1、TIM3、CXCR6、TOX，以及效應分子如IFN-γ和GZMB。抗體介導的CD8+T細胞的耗竭恢復了Mcj-KO腫瘤的生長，證實了CD8+T淋巴細胞在腫瘤控制中的作用。
接下來，進行單細胞轉錄組學和單細胞TCR測序，以分析YUMM1.7 Mcj KO和sgSCR腫瘤CD8+T細胞的mRNA和TCRαβ庫。盡管sgSCR腫瘤中的大多數CD8+T細胞聚集在一起并顯示出記憶性CD8+T的特征，但來自Mcj KO腫瘤的CD8+T細胞聚集成PD1+CXCR6+CD8+T，PD1+XCL1+CD8+T細胞，以及增殖的PD1+CD8+T細胞。來自對照的大多數CD8+T細胞具有獨特的單TCR克隆型，但來自Mcj KO的CD8+T細胞由表達Pdcd1、Cxcr6、Gzmb，和IFNγ基因的超擴增克隆組成。總之，增加細胞內腫瘤琥珀酸鹽和MHC-I（通過Mcj KO或直接CII抑制）增強了腫瘤細胞的免疫原性，并增強了抑制腫瘤生長的更多腫瘤反應性效應CD8+T細胞的激活和浸潤。因此，這種ETC重構的方法可能代表了一種將冷腫瘤轉化為熱腫瘤并提高抗腫瘤反應和免疫治療效果的新方案。
圖 OXPHOS治療概念性證明
小結：
本文中作者團隊證明，在腫瘤細胞中由CII抑制引起的琥珀酸鹽積累降低了α-酮戊二酸鹽/琥珀酸鹽的比率，隨后抑制了組蛋白去甲基化酶。這些表觀遺傳酶的抑制增加了H3K4和H3K36對參與抗原處理和呈遞的基因的三甲基化，從而誘導了這些基因的表達并激活了T細胞介導的腫瘤細胞殺傷。這些變化被α-酮戊二酸補充而逆轉。全身抑制CII活性不是一種可行的治療方法，因為可能會產生副作用，包括神經毒性。相反，作者團隊提出了癌癥細胞線粒體中電子傳輸鏈重排。甲基化控制的J蛋白（MCJ）的敲除增強了通過CI的電子流。這降低了CII的活性，導致琥珀酸鹽的積累和更高的抗腫瘤免疫力。這種方法可以提高免疫治療的成功率，尤其是在抗原處理和呈遞基因表達低的腫瘤中。
這些研究結果引發了幾個后續問題。如抑制CII活性阻止腫瘤生長的觀察結果似乎與琥珀酸作為腫瘤促進代謝產物的既定作用相矛盾。作者討論說明這可能是由促進腫瘤的CII突變發生的背景影響。大多數功能喪失CII突變是遺傳的，因此存在于腫瘤發生的早期階段，促進腫瘤的發生和發展。此外，CII種系突變可能與其他致癌基因改變共存，并協同刺激腫瘤的發生和發展，掩蓋了琥珀酸可能的抗腫瘤作用。未來的研究應該闡明琥珀酸發揮致癌或抗腫瘤作用的分子機制。
目前尚不清楚琥珀酸是如何從線粒體輸出到細胞核中并改變基因表達的。線粒體二羧酸鹽載體（SLC25A10）是線粒體琥珀酸鹽載體，但其是否參與以及其活性的改變是否與所提出的琥珀酸-組蛋白去甲基化酶-免疫原性軸有關仍有待探索。此外，琥珀酸可能通過核膜上的孔隙擴散到細胞核中。然而，維持線粒體和細胞核這兩個不同的琥珀酸庫并阻止不必要的細胞器間易位的機制仍然難以捉摸。作為一種可能的解釋，最近的研究已經確定了細胞核中的非經典三羧酸循環，其局部產生琥珀酸。然而，目前尚不清楚如何及時、準確地將琥珀酸從線粒體轉運到細胞核。事實上，線粒體、胞質溶膠和細胞核的生物物理性質不同都會阻礙細胞器間運輸。
不可否認的是作者團隊的研究結果在多個層面上都令人興奮。線粒體代謝產物與免疫原性的表觀遺傳學調節之間的聯系，可能對免疫學和以琥珀酸積累為特征的條件的研究（如缺血再灌注損傷）具有廣泛的意義。這些發現還表明，靶向線粒體代謝可能是癌癥免疫療法的有效方法，以增強免疫檢查點抑制劑的作用。
參考文獻：
Manipulating mitochondrial electron flow enhances tumor immunogenicity. Science 2023.
DOI: 10.1126/science.abq1053
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq1053
