人們發現，酶催化劑具有優異的立體選擇性，但是酶催化劑的反應性控制和自由基立體控制遠遠不如化學催化劑。人們通過研究焦磷酸硫胺素（ThDP, Thiamine diphosphate）依賴酶，發展了N雜環卡賓，但是目前還沒有能夠不對稱自由基催化轉化的相關方法學。而且由于自然更傾向于避免形成對生物體有害的自由基物種，因此目前還未曾發展一種具有生物兼容和普適性的自由基生成機理。 有鑒于此，南京大學黃小強、梁勇和中國科學技術大學田長麟等通過蛋白質工程，并且將酶催化與有機光催化劑結合，發展了一種ThDP裂解酶進行立體選擇性自由基酰基轉移酶RAT（radical acyl transferase）。在光照射作用下，光催化-酶催化體系通過光激發有機染料分子的單電子氧化生成酮自由基，隨后能夠與前手性烷基自由基以立體選擇性方式偶聯。這種光-酶催化體系能夠從醛和氧化還原活性酯原料生成多種多樣的酮，在35個反應例子中，立體選擇性ee最高達到97 %。反應機理研究結果顯示，這是個未曾報道的酶催化/光催化體系，能夠導向自由基在ThDP輔酶進行立體選擇性的反應。這項工作不僅拓展了生物催化的應用，而且發展了控制自由基與酶反應的獨特方法，這種獨特的方法與目前的化學催化反應方法學能夠互補。通過酶催化的立體選擇性與光催化結合，實現控制自由基中間體的立體反應選擇性。自由基應用場景廣泛，但是控制自由基的化學反應選擇性非常困難自由基是反應活性非常高的反應中間體，自由基在天然產物合成、材料科學、藥物、工業制造等多種領域表現廣闊應用前景。但是自由基物種具有非常高的反應活性，導致調控自由基中間體的化學反應選擇性和立體選擇性一直都是巨大的困難與挑戰。
大多數的酶通常以兩電子反應過程，以單電子轉移反應方式進行的自由基酶比較罕見。比如，ThDP酶廣泛存在于許多有機體，通常ThDP酶能夠以親核加成方式將不同的碳陰離子烯胺（Breslow反應中間體）與親電試劑進行C-C偶聯反應或者切斷C-C化學鍵。一個比較重要的ThDP酶催化反應是苯甲醛裂解酶催化苯偶姻縮合反應（benzoin condensation）。 目前報道的非常罕見的例子中，人們發展了丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶（PFOR, pyruvate:ferredoxin oxidoreductase）實現了單電子氧化反應方式對CoA實現乙酰基化。但是ThDP是否能夠以立體方式進行自由基轉化還并不了解。通過優化反應體系改善反應體系催化活性。使用4-甲氧基苯甲醛和N-(酰氧基)鄰苯二甲酰亞胺反應物，在體系中加入ThDP酶和eosin Y光催化劑。并且在530-540 nm和N2氣氛進行催化反應，篩選多種ThDP酶，考察最合適的酶。發現熒光假單胞菌PfBAL（Pseudomonas fluorescens ）具有一定的酶催化活性，目標產物的產量能夠達到33 %，立體選擇性ee為38 %。通過迭代位點突變策略優化立體選擇性。通過對各種突變的變體篩選，發現其中T481L_A480L變體給出較好的立體選擇性，立體選擇性達到96 %。通過智能和高質量的變體優化策略，獲得了反應性能合適的RAT2酶。隨后對光催化劑、反應緩沖液pH、助溶劑、ThDP的量等反應參數優化，目標產物的產量達到60 %，立體選擇性達到96 %。
反應體系表現了對位修飾供電子/缺電子的芳基醛（3a-3m）表現優異的兼容性，鄰位和間位修飾的底物同樣具有可接受的反應性（3n和3o），但是反應產物產率和立體選擇性有所降低。對于修飾鹵原子（3h-3k, 3w-3aa）、萘（3p），以及吡唑（3q）、吡啶（3r）、苯并噻吩（3s）、N-甲基吲哚（3t）等雜芳烴醛同樣表現很好的反應活性。對于N-(酰氧基)鄰苯二甲酰亞胺等底物能夠轉化為α-手性酮，具有較好的產率和優異的立體選擇性（86-97 % ee）。這種光-酶催化反應方法能夠將多種市售消旋藥物大分子轉化，比如loxoprofen（3ae，洛索洛芬）、flurbiprofen（3af，氟比洛芬）、天然有機醛（3ag）。此外，能夠將脂肪族自由基（3ad）、大體積叔碳自由基（3ai）立體選擇性催化轉化，因此說明該反應的廣闊應用前景。作者考察該反應的大量合成，發現能夠將1 mmol量級的3a和3g轉化，產率分別達到52 %和85 %。該反應方法具有條件溫和、普遍適應、官能團兼容性好等優勢，因此能夠用于合成重要的α-手性有機酮。
基于相關文獻，提出光催化和酶催化雙重機理。首先ThDP與有機醛分子反應生成關鍵Breslow中間體（Int.A），Int.A容易發生單電子氧化。Eosin Y發生光激發生成激發態的eosinY*，激發態的氧化電極電位為E1/2(eosinY*/eosinY·-)=+0.83 V。通過單電子轉移生成酮自由基物種Int.B和eosin Y自由基陽離子。Eosin Y能夠還原N(酰氧基)-鄰苯二甲酰亞胺生成前手性苯甲基自由基Int.C。最后Int.B和Int.C發生自由基偶聯構筑C(sp2)-C(sp3)化學鍵，得到產物分子，同時重新形成具有催化活性的RAT。此外，作者通過DFT理論計算和MD分子動力學模擬，研究該反應立體選擇性的原因。 Yuanyuan Xu, Hongwei Chen, Lu Yu, Xichao Peng, Jiawei Zhang, Zhongqiu Xing, Yuyan Bao, Aokun Liu, Yue Zhao, Changlin Tian, Yong Liang & Xiaoqiang Huang, A light-driven enzymatic enantioselective radical acylation. Nature (2023)DOI: 10.1038/s41586-023-06822-xhttps://www.nature.com/articles/s41586-023-06822-x
