單分子及痕量分子水平檢測是人類對物質世界認知的一貫追求。自從1974年，表面增強拉曼光譜（SERS）發現以來，到1997年，單分子表面增強拉曼散射（SM-SERS）現象的發現，SM-SERS技術的檢測能力達到了超靈敏的單分子水平，從而受到了物理、化學和生物醫學等研究者的廣泛青睞。然而，經過二十余年的發展，面對目前商業化和實際應用需求，SM-SERS的超高靈敏度的優勢尚未在多種分子和真實樣品檢測中得以充分發揮。
從SERS到SM-SERS，電磁場增強機制及熱點效應一直在其理論研究方面占據主流地位。在過去的幾十年里，研究人員主要關注了光-納米結構的相互作用這一基本科學問題，通過納米技術創造了各種類型的SERS基底并實現了對熱點的調控。然而，1997年所報道的SM-SERS呈現出一種典型的“on and off”時序波動現象，這種閃爍信號行為在SM-SERS的實際應用中是非常不利的。因為，商業檢測中更需要高度可重復、均勻、穩定的SERS及SM-SERS信號。
針對以上問題，西安交通大學生命學院方吉祥教授團隊基于對早期SERS和SM-SERS研究的深入理解，及分子-納米結構相互作用及相關機制的深入研究，在本工作中，提出了一種限域增強拉曼光譜（CERS）新概念及避免SM-SERS閃爍信號的新機制，在SM-SERS信號穩定性、重現性及靈敏度方面，均得到顯著提升。相關工作以“Confined-Enhanced Raman Spectroscopy”為題于2023年12月13日發表在《Nano Letters》上。該論文以西安交通大學生命科學與技術學院為本工作的第一作者及通訊作者單位，該研究得到了廈門大學化學化工學院李劍鋒教授及南京大學化學與化工學院龍億濤教授的幫助與支持。以上工作得到了國家自然科學基金、西安交通大學創新團隊項目支持。
該方法是在SERS檢測過程中，在銀、金甚至其他等離激元納米材料表面原位構建一個活性的封裝殼層(圖1)。這種活性封裝殼層可以將待測分子限域并錨定在等離激元納米粒子表面，以避免待測分子的吸附-解吸附行為，從而避免SM-SERS光譜的閃爍信號。本工作首次在金膠體納米粒子體系中實現對待測物的超高靈敏度、高穩定性和高信號重復性的單分子/少分子水平的檢測。此外，在實際應用中，可以通過設計具有不同組分的封裝殼層，使該策略廣泛適用于包括生物醫學診斷、催化反應機制研究等多種分子系統的SM-SERS檢測。
圖1 SERS和SM-SERS的傳統概念以及CERS策略示意圖和原位封裝活化層的表征
作者基于Ag NPs的SERS檢測策略評估原位封裝活化層的作用效果，通過優化NaCl的使用量，可以在SERS檢測中實現接近單分子水平的檢測限。當NaCl的使用量為100微升時，CV分子的檢測限(LOD)達到fM水平,比NaCl過量使用時的LOD值提升了近7?8個數量級(圖2a)。如此巨大的SERS性能差異值得引起重點關注！
針對不同NaCl使用量所對應的表面成分進行表征，可以發現，少量的NaCl只會導致Ag NPs輕微聚集，形成小的團簇，并保持原來的球形形狀。過量的NaCl加劇了Ag NPs的聚集程度，且Ag NPs似乎融合并連接在一起，很難區分單個粒子。這可能是由于Ag NPs中釋放出來的Ag+離子，與加入的NaCl形成二次析出物如AgCl，并包覆在聚集的Ag NPs表面。由此，該工作不僅揭示了1997年SM-SERS活化層的作用機制，而且該原位形成的活化層，還可以作為封裝層，將待測物分子包裹、限域并錨定在活化封裝層內，從而避免分子的解吸附行為。因此，作者將具有該物理過程的SERS檢出新策略命名為限域增強拉曼光譜(CERS)。
受上述發現的啟發，作者將CERS的概念引入到目前商業化最為廣泛使用的Au NPs體系中。將CV分子加入到Au膠體中，隨后加入聚沉劑NaCl和少量AgNO3，在Au NPs聚集過程中原位形成AgCl活化封裝層。令人興奮的是，在Au NPs體系中，基于CERS法檢測CV的LOD可以達到pM水平(圖2b)，遠優于基于溶液聚沉法測定的LOD(10-8 M)。這是首次在Au NPs膠體體系中實現高穩定、高信號重現性的單/少分子水平檢測！
為了進一步研究現有CERS策略的光譜特性，作者測試了Au膠體體系中CV分子的時間分辨拉曼光譜。作為比較，設定了三種不同的實驗條件來收集時間分辨拉曼光譜，包括（1）采用沒有原位封裝活化層的Au NPs作為SERS襯底；（2）通過將NaCl和AgNO3先加入到Au NPs中，使Au NPs預先被AgCl層活化，隨后加入CV分子；（3）利用CERS策略，先添加CV分子到Au NPs中，然后加入NaCl和AgNO3形成原位活化封裝層。在沒有活化封裝層的條件下，信號均表現為典型的單分子行為，即隨機閃爍效應 (圖3a和3b)。然而，在CERS方案中，SERS信號表現出截然不同的行為，在pM的CV分子濃度下仍然可以檢測到穩定的拉曼信號，而在0.1 pM濃度下無法檢測到信號(圖3c)。通過縮短濃度間隔和積分時間，仍然沒有檢測到典型單分子SERS的閃爍信號。
圖3 不同條件下Au NP體系中CV分子的時間分辨SM-SERS檢測
圖4 基于CERS策略的無標記核酸序列檢測
目前，對于轉換效率低或催化劑表面吸附弱的催化體系，現有技術難以獲得對其反應過程的動態監測。本工作中，作者利用CERS策略實現了對氨基噻吩(4-ATP)分子催化反應過程的動態監測，且在較低的分子濃度(10-7 M)時(圖5)，仍然可以監測催化反應過程。CERS策略的優勢也體現在對金表面的親和力較弱及SERS靈敏度較低的探針分子的檢測，如對硝基苯胺(p-NA)分子的原位催化反應過程。因此，在低濃度的催化分子或低轉化效率的弱催化反應體系中，CERS策略所具有的超高靈敏度特性在原位監測催化過程和研究機理方面顯示出廣泛的應用潛力。
總而言之，CERS新概念的提出，不僅闡明了避免SM-SERS“閃爍“信號特征的新機制，而且首次在現有商用化的金膠體納米顆粒體系中實現了高穩定性、高靈敏度的單分子/少分子水平的檢測。因此，CERS不僅是當前商業化中廣泛使用的SERS策略的改進方案，而且在無標記生物診斷、環境保護和公共安全等諸多領域也顯示出良好的應用前景。
論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.nanolett.3c03734
研究團隊主頁鏈接：https://gr.xjtu.edu.cn/en/web/jxfang/1
