人物介紹
弗朗西絲·阿諾德是一位才華橫溢的美國(guó)化學(xué)家和工程師，她是加州理工學(xué)院的化學(xué)工程、生物工程著名教授，也是2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主，以她在定向進(jìn)化方面的開(kāi)創(chuàng)性工作而聞名。她的科學(xué)信念和責(zé)任感激發(fā)了無(wú)數(shù)后輩科學(xué)家，并在她的職業(yè)生涯中留下了深刻的印記。Frances H. Arnold教授。圖片來(lái)源：Arnold教授課題組阿諾德教授一直將科學(xué)看作一項(xiàng)使命，她希望通過(guò)自己的研究為人類(lèi)社會(huì)做出實(shí)質(zhì)性的貢獻(xiàn)。她不僅關(guān)注自己領(lǐng)域內(nèi)的科研進(jìn)展，還對(duì)其他領(lǐng)域的優(yōu)秀研究給予高度評(píng)價(jià)和支持。她鼓勵(lì)年輕的科學(xué)家們積極參與解決全球性挑戰(zhàn)，相信每個(gè)人都可以為這個(gè)世界做出有意義的貢獻(xiàn)。從左至右：Frances H. Arnold教授、George P. Smith教授和Gregory P. Winter爵士。圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)出生于賓夕法尼亞州匹茲堡市的阿諾德從小展現(xiàn)出強(qiáng)烈的獨(dú)立性和好奇心。她的職業(yè)生涯始于加州理工學(xué)院，她在那里進(jìn)行了深入的研究，致力于改進(jìn)酶的功能，通過(guò)借鑒自然選擇的原理，使其性能得到顯著提升。她的成果不僅在學(xué)術(shù)界引起轟動(dòng)，還為生產(chǎn)生物燃料、藥物等提供了新的可能性。正如阿諾德（Frances Arnold）在加州理工學(xué)院的一份新聞稿中說(shuō)："我們決定讓自然去做只有化學(xué)家才能做到的事情，而且做得更好。"為此，弗朗西絲·阿諾德團(tuán)隊(duì)和陶氏有機(jī)硅公司的Dimitris E. Katsoulis合作，研發(fā)了一種細(xì)胞色素P450酶，該研究證明了生物學(xué)可以比傳統(tǒng)化學(xué)家更環(huán)保的方式形成這些鍵。使用了定向進(jìn)化來(lái)創(chuàng)建這種新的硅碳鍵斷裂酶。這一研究成果發(fā)表在《科學(xué)》雜志的1月26日的期刊上。接下來(lái)我們一起來(lái)了解一下這項(xiàng)解決世界難題的文章。
研究背景
隨著現(xiàn)代化工技術(shù)的不斷發(fā)展，人類(lèi)生產(chǎn)出大量的揮發(fā)性硅氧烷（VMS），這些化合物在消費(fèi)品行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用，從洗滌劑和消泡劑到洗發(fā)水、護(hù)發(fā)素等。然而，盡管這些化合物的功能性和實(shí)用性得到了充分肯定，但其對(duì)環(huán)境的潛在影響引發(fā)了人們的擔(dān)憂。VMS被認(rèn)為是不可生物降解的化學(xué)物質(zhì)，其在環(huán)境中的長(zhǎng)期存在和生物累積可能帶來(lái)潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。在這種背景下，科學(xué)家們開(kāi)始關(guān)注硅氧烷Si-C鍵的降解問(wèn)題。由于其高熱穩(wěn)定性和缺乏功能性基團(tuán)，傳統(tǒng)的化學(xué)手段在處理VMS的Si-C鍵裂解上受到了限制，僅有少數(shù)幾種方法可以實(shí)現(xiàn)，包括TiO2光催化、熱解和大氣中的羥基自由基氧化。在高等生物體內(nèi)的研究表明，VMS經(jīng)過(guò)代謝會(huì)產(chǎn)生多種產(chǎn)物，包括Si-C鍵斷裂的代謝產(chǎn)物，這被認(rèn)為是在C-H羥基化事件之后發(fā)生的。盡管如此，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)任何一種酶能夠羥基化硅氧烷的C-H鍵，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)Si-C鍵斷裂的酶。 鑒于此， Frances H. Arnold提出科學(xué)假說(shuō)。假設(shè)細(xì)菌色素P450可能具有將硅氧烷的C-H鍵氧化的能力，從而為Si-C鍵的斷裂提供可能。通過(guò)對(duì)一系列細(xì)菌色素P450BM3變體進(jìn)行評(píng)估，他們發(fā)現(xiàn)了一種具有促進(jìn)硅氧烷Si-C鍵斷裂活性的變體，命名為L(zhǎng)SilOx1（線性硅氧烷氧化酶，第1代）。隨后，通過(guò)定向進(jìn)化，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步提高了這種酶的Si-C鍵斷裂活性，并拓展了其對(duì)不同硅氧烷底物的適用范圍，包括線性硅氧烷和環(huán)狀硅氧烷（見(jiàn)圖2）。最終，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種具有Si-C鍵斷裂活性的酶，其具有潛力在溫和條件下裂解硅氧烷的Si-C鍵，這是以往的化學(xué)催化劑無(wú)法實(shí)現(xiàn)的活性，并且也是酶在非自然底物上首次展現(xiàn)出的活性。相關(guān)論文近日以題為“Directed evolution of enzymatic silicon-carbon bond cleavage in siloxanes”發(fā)表在Science上，引起了不小的關(guān)注。
研究?jī)?nèi)容
為解決這一問(wèn)題，研究人員首次合成了一種能夠在生物體內(nèi)形成硅碳鍵的方法。通過(guò)將硅和碳元素引入生物體內(nèi)，科學(xué)家們成功地誘導(dǎo)了生物體合成硅碳鍵，實(shí)現(xiàn)了硅碳鍵在自然界的合成。為了驗(yàn)證這一合成的有效性，研究人員使用了一系列表征手段和測(cè)試方法，包括高分辨質(zhì)譜分析、核磁共振技術(shù)等。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，科學(xué)家們證實(shí)了硅碳鍵的形成，為探索新型材料和化學(xué)合成提供了全新的思路和方法。如圖1所示，研究人員展示了在生物體內(nèi)合成硅碳鍵的過(guò)程。首先，硅和碳元素被引入生物體內(nèi)，隨后經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)，生物體內(nèi)的特定分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成了硅碳鍵。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，研究人員成功地觀察到了生物體內(nèi)硅碳鍵的形成過(guò)程，并使用高分辨質(zhì)譜分析、核磁共振技術(shù)等表征手段對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證和確認(rèn)。這一發(fā)現(xiàn)為生物合成領(lǐng)域帶來(lái)了新的可能性和機(jī)遇，為探索新型材料和化學(xué)合成提供了新的思路和方法。
圖1. 選定揮發(fā)性硅氧烷的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。ppb，十億分之一；d，天。圖2展示了研究人員在生物體內(nèi)合成硅碳鍵的具體步驟和過(guò)程。分別展示了在實(shí)驗(yàn)中使用的不同硅氧烷衍生物，包括六甲基二硅氧烷（1）、八甲基三硅氧烷（2）和八甲基四硅氧烷（3）。通過(guò)在大腸桿菌溶液中進(jìn)行的定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)，研究人員獲得了一系列新的酶變體，這些變體在催化硅碳鍵的裂解過(guò)程中展現(xiàn)出了不同的活性和特性。圖中詳細(xì)描述了在不同硅氧烷衍生物上進(jìn)行的定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)，以及隨著進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生的酶變體的逐漸積累的氨基酸替換情況，為生物體內(nèi)硅碳鍵裂解的機(jī)理和新型酶催化反應(yīng)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
圖2. 在大腸桿菌裂解液中使用六甲基二硅氧烷（1）、八甲基三硅氧烷（2）和八甲基環(huán)四硅氧烷（3）進(jìn)行定向進(jìn)化。圖3展示了對(duì)酶催化硅碳鍵斷裂機(jī)制進(jìn)行的調(diào)查。首先，在圖3A中，顯示了Si-C鍵斷裂活性與NADPH濃度之間的關(guān)系，結(jié)果表明Si-C鍵斷裂活性依賴(lài)于NADPH的濃度。在圖3B中，LSilOx4DFAD變體中FAD結(jié)構(gòu)域的截?cái)鄬?dǎo)致從羥甘醇4的Si-C鍵裂解活性下降了2.6倍，這進(jìn)一步驗(yàn)證了催化氧化對(duì)Si-C鍵斷裂的重要性。圖3C通過(guò)使用ABTS甲醇試驗(yàn)和purpald甲醛試驗(yàn)進(jìn)行了反應(yīng)分析，結(jié)果顯示甲醛作為酶反應(yīng)的副產(chǎn)物生成。通過(guò)對(duì)照反應(yīng)使用甲醇或甲醛作為底物，而不是硅氧烷1或羥甘醇4，證實(shí)了Si-C鍵裂解活性的產(chǎn)物為甲醛。最后，在圖3D中，展示了以硅氧烷1或羥甘醇4作為底物的酶反應(yīng)時(shí)間過(guò)程。這些結(jié)果共同揭示了硅碳鍵斷裂的酶催化機(jī)制，為理解生物體內(nèi)硅碳鍵降解的機(jī)理提供了重要的實(shí)驗(yàn)支持和指導(dǎo)。
圖3. 酶催化Si-C鍵裂解的機(jī)制研究。
圖4展示了硅氧烷甲基團(tuán)在生物體內(nèi)經(jīng)歷串聯(lián)雙酶氧化過(guò)程，最終導(dǎo)致硅碳鍵的裂解。該圖描述了在與羥甘醇4進(jìn)行酶反應(yīng)的過(guò)程中，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析檢測(cè)到的微量峰，例如在5分鐘反應(yīng)中觀察到的情況（圖A）。隨后，通過(guò)Swern氧化羥甘醇4，利用核磁共振（NMR）技術(shù)對(duì)甲醛硅氧烷10進(jìn)行原位合成的1H NMR表征（圖B）。在圖C中，展示了通過(guò)用羥甘醇4作為底物進(jìn)行5分鐘反應(yīng)后所獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，揭示了酶催化Si-C鍵裂解的可能機(jī)制。這一機(jī)制涉及了酶C-H羥基化和羥甘醇氧化，最終形成甲醛硅氧烷10。這些結(jié)果為生物體內(nèi)硅碳鍵裂解的反應(yīng)機(jī)理提供了重要線索，并為進(jìn)一步的研究提供了基礎(chǔ)和指導(dǎo)。
圖4. 硅氧烷甲基團(tuán)的串聯(lián)雙酶氧化導(dǎo)致硅碳鍵裂解。
展望
本文主要核心在于通過(guò)定向進(jìn)化工程，成功實(shí)現(xiàn)了生物催化的硅碳鍵裂解活性，為揮發(fā)性甲基硅氧烷（VMS）的生物降解提供了新的途徑。VMS是大規(guī)模生產(chǎn)的人工化學(xué)物質(zhì)，廣泛用于洗滌劑、防泡劑、護(hù)膚品等消費(fèi)品中。然而，由于其不易降解的特性，引發(fā)了對(duì)其在環(huán)境中的潛在積累、長(zhǎng)距離傳播和生物富集的擔(dān)憂。 通過(guò)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞色素P450BM3的定向進(jìn)化，研究人員成功改良了其對(duì)線性和環(huán)狀VMS硅碳鍵的裂解能力。通過(guò)催化硅氧烷甲基基團(tuán)的串聯(lián)氧化反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)了硅碳鍵的裂解。這一發(fā)現(xiàn)為VMS的生物降解提供了新的前景，打破了以往對(duì)于這類(lèi)化合物生物不可降解的觀念。通過(guò)定向進(jìn)化，研究人員創(chuàng)造性地改造了天然酶的催化性能，為處理這類(lèi)具有高熱穩(wěn)定性和缺乏功能基團(tuán)處理手柄的化合物提供了生物降解的可能性。Nicholas S. Sarai et al. ,Directed evolution of enzymatic silicon-carbon bond cleavage in siloxanes.Science383,438-443(2024).DOI:10.1126/science.adi5554.
