在自然界中，生物進化孕育了精密且動態的納米結構，它們能夠根據pH值和其他環境條件進行重構。這些結構在生物體中扮演著至關重要的角色，如蜘蛛絲蛋白的pH敏感開關控制其固態絲的生成，CTP合成酶絲狀體在低pH下聚合以幫助酵母在饑餓期間維持內穩態，以及R體通過局部構象變化響應pH變化產生力。
這些材料激發了生物工程師嘗試設計依賴于pH的蛋白材料。盡管已有研究通過模仿絲蛋白結構域和引入組氨酸殘基來生產pH響應性納米材料，但從頭設計具有精確定義結構和可調pH轉變點的pH響應性纖維仍是一個未解決的挑戰。
鑒于此，華盛頓大學David Baker、Hao Shen等研究人員描述了一種全新的pH響應性蛋白纖維的設計。這些纖維由含有六個或九個埋藏組氨酸殘基的亞基組成，在中性pH下組裝成微米尺度的有序纖維。通過冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)確定了優化設計的結構，其與計算設計模型幾乎一致，無論是亞基內部幾何形狀還是亞基在纖維中的堆積方式。
設計pH響應纖維
研究人員通過計算設計方法成功創造了能夠在特定pH變化下自組裝和解組裝的蛋白纖維。他們設計了含有多個埋藏組氨酸殘基的亞基，這些殘基在pH變化時改變其質子化狀態，從而觸發纖維的組裝和解組裝。通過篩選和表達18個不同的設計，研究人員發現DpHF7和DpHF18能夠在降低pH值時解組裝，并在pH值回升時重新組裝，展示了對pH變化的敏感和可調節的響應性。
圖|產生pH依賴性蛋白質纖維的設計策略
結構分析
研究使用了cryo-EM技術來確定DpHF7和DpHF18的高分辨率結構。DpHF18亞基結構和纖維中最大的亞基界面在cryo-EM結構和計算模型中非常相似。然而，第二個小的異質界面偏離了設計模型，導致了除了主界面生成的螺旋對稱性外，還出現了反平行二面角對稱性(D1)。通過第二輪序列設計，明確傾向于設計的纖維堆積排列，并確定了對第二個界面帶電殘基的五個替換。這些重新設計，稱為DpHF19，容易形成纖維，cryo-EM結構顯示其結構非常接近設計模型。
圖|設計纖維的冷凍電鏡結構表征
pH響應特性
為了確定pH轉變中點是否可以通過設計進行調節，研究人員制作了一個版本，增加了三個額外的埋藏組氨酸殘基（總共九個），稱為DpHF19_9his。通過使用負染色EM對設計的纖維進行pH響應性表征，DpHF18、DpHF19和DpHF19_9his在pH 8下組裝成纖維，然后通過添加檸檬酸將pH降低到6、5、4.2、3.5或3，然后通過添加1M Tris-HCl在pH 8下重新升高。通過cryoSPARC軟件的纖維追蹤方法量化纖維長度，結果顯示DpHF18、DpHF19和DpHF19_9his在pH 3.5、3和4.2分別解組裝，并在pH從3重新升高到8時重新組裝。這表明pH轉變是可逆的，并且可以通過增加埋藏組氨酸的數量來增加pH轉變中點。
圖|通過電鏡和熒光顯微鏡表征纖維組裝和拆卸
動態研究
為了實時表征pH誘導的構象變化，研究人員通過半胱氨酸與磺酸-Cy5 maleimide或Oregon488染料的結合對DpHF18進行了標記。使用全內反射熒光顯微鏡(TIRFM)監測纖維組裝，觀察到在pH 8下，預組裝的DpHF18–Cy5纖維與新解組裝的DpHF18–Oregon488單體混合時，Oregon488標記的纖維在Cy5標記的種子纖維的兩端生長。通過在流動池中用TIRFM成像，研究了DpHF18纖維解組裝的動態，觀察到在pH從8降至3的過程中，纖維在不到1秒的時間內解組裝。
圖|通過液相AFM監測纖維分解的動力學
小結
本研究展示了通過計算設計方法創造微米尺度pH響應性纖維的能力，這在環境響應性蛋白納米材料的設計中是一個進步。所描述的兩種纖維系統表現出顯著且可調的pH依賴性解組裝特性：DpHF18–Cy5在pH 3.4時保持組裝，但在pH 3.1時解組裝；而DpHF19_9his在pH 4.5時組裝，在pH 4.4時解組裝。這種pH依賴性的銳度可能源于大量的可質子化基團：每個亞基包含六個(DpHF18和DpHF19)或九個(DpHF19_9his)埋藏組氨酸，纖維包含數百個亞基。亞基的緊密堆積顯著降低了纖維解組裝的pH值，使得解組裝具有高度的協同性。將設計的纖維納入水凝膠或其他高階材料中，可能會繼承其pH依賴性，為藥物遞送和其他應用中環境觸發的嵌入組分釋放提供新的途徑。更一般地說，精確設計具有原子尺度分辨率的可重構無界蛋白系統的能力，為創造復雜的環境敏感納米材料開辟了新的機會。
盡管這項研究取得了顯著的成果，但仍有改進的空間。例如，通過深度學習方法提高界面設計的準確性，以及開發新一代的石墨烯基液態電池和高靈敏度直接電子探測器，可能有助于未來通過液態相透射電子顯微鏡成像纖維組裝和解組裝的早期中間體。
這些進步將進一步推動環境響應性蛋白納米材料的設計和應用，為生物醫學和材料科學領域帶來新的突破。
參考文獻：
Shen, H., Lynch, E.M., Akkineni, S. et al. De novo design of pH-responsive self-assembling helical protein filaments. Nat. Nanotechnol. (2024).
https://doi.org/10.1038/s41565-024-01641-1
