特別說明：本文由米測技術中心原創撰寫，旨在分享相關科研知識。因學識有限，難免有所疏漏和錯誤，請讀者批判性閱讀，也懇請大方之家批評指正。
研究背景
從致癌誘變劑和早期疾病標記物到環境污染物和生物恐怖制劑的檢測，對復雜混合物中極低濃度的各種分子進行定量檢測一直是許多科學和工程領域的主要目標。因此，開發無需外部標記或修改即可檢測這些分析物的技術非常有價值，也是這些領域進行定量檢測的首選。在這方面，表面增強拉曼光譜可以僅根據其內在和獨特的振動特征來檢測復雜混合物中的分子種類。
關鍵問題
1、表面增強拉曼光譜對于單分子的定量檢測重現性和準確性差由于不同的分子取向和異質電磁場等因素，表面增強無法得到很好的控制，導致顯著的單分子強度波動（SIF）。因此，基于所有單分子信號積分強度的定量（即模擬測量）在低濃度下變化很大，無法達到所需的重現性和準確性。2、基于固體基質的表面增強拉曼光譜可靠性和靈敏度受限即使在嚴格的制造條件下，固體基質在給定基質中和不同基質之間也是異質的，并且由于測量過程的不可逆性，這些差異無法通過校準來糾正。此外，固體基質中有限的熱點數量以及目標捕獲的不可逆性導致合格的單分子事件很少，嚴重限制了基于固體基質的方法的可靠性和靈敏度。
新思路
有鑒于此，上海交通大學葉堅等人提出了一個概念證明，表明使用數字（納米）膠體增強拉曼光譜，可以通過單分子計數常規地實現對極低濃度的各種目標分子的可重復定量，僅受測量過程的泊松噪聲限制。由于增強這些振動特征的金屬膠體納米顆粒（包括羥胺還原銀膠體）可以在常規條件下大規模制造，預計數字（納米）膠體增強拉曼光譜將成為可靠和可靠的技術的首選技術。該技術可以對各種分析物進行超靈敏檢測，包括對人類健康非常重要的分析物，為表面增強拉曼光譜的應用提供了研究基礎。1、提出了數字（納米）膠體增強拉曼光譜（dCERs）概念作者開發了基于銀膠體的增強拉曼光譜，并驗證了其單分子靈敏度以及通過雙分析物 SERS 技術進行單分子計數的適當范圍。 作者量化了dCERs測量的準確性，結果表明每個濃度測得的單分子事件的相對標準偏差（RSD）符合泊松分布。作者分別通過分散在同一溶液中的不同濃度的兩種不同目標分子的混合物、百草枯及福美雙的低濃度定量檢測，證實了DCERs的有效性。作者通過分散在水溶液中的金屬膠體納米顆粒，廣泛的分子目標的單分子拉曼特征得到充分增強，從而能夠識別目標單分子。2、獲得了超低濃度目標分子的可靠定量檢測（毫摩爾級）并且通過單分子計數，這些目標分子可以以前所未有的精度進行可重復量化，最終的檢測水平僅受測量過程的泊松噪聲限制。作者使用含有10μl金屬膠體懸浮液的石英毛細管來生成目標分子的增強拉曼光譜，使用掃描探針系統以逐點掃描模式獲取每個樣品的拉曼光譜，使用銀膠體是因為它們在測量過程中具有分散穩定性，并且具有出色的拉曼增強能力。借助該系統，首先使用羥胺還原銀(Hya–Ag)膠體(ζ)驗證了其單分子靈敏度以及通過雙分析物SERS技術進行單分子計數的適當范圍，但由于目標-熱點相互作用的復雜性，單分子計數的適當濃度范圍預計會在很大范圍內變化。因此，必須預先確定預期目標分子的適當單分子范圍，以滿足數字（納米）膠體增強拉曼光譜（dCERS）的要求。此外，作者通過檢查不同濃度的代表性目標分子證明了dCERS 的概念。 接下來，作者試圖量化這些測量的準確性，使用結晶紫和 Hya-Ag 膠體作為測試用例，在多個濃度下進行了多次測量，并計算了每個濃度的平均值和測量誤差。結果表明每個濃度測得的單分子事件的相對標準偏差（RSD）符合泊松分布，變化為1/√N，其中N是陽性單分子事件的總數每次測量共有 5,400 個體素。因此，隨著測量更多的正體素，特定濃度的單次測量的準確性必須提高，這將需要采集更多的體素，從而需要更長的測量周期。結果強烈表明，基于離散單分子事件的測量通常應在很大程度上遵循泊松分布，因此，可實現的測量精度應由累積的正事件決定（和預測），而這僅受無論分析物濃度或特定系統的檢測效率如何，可接受的測量持續時間和測量期間（背景）假陽性的數量。當RPV及其不確定度已知時，可以從預校準的對應曲線中恢復實際分析物濃度及其準確性。 為了進一步證明dCERS的有效性，作者對分散在同一溶液中的不同濃度的兩種不同目標分子的混合物（結晶紫和尼羅藍）進行了定量。結果都顯示出與僅存在一種分析物時測量的相同關系。此外，盡管兩種分析物的相對濃度存在兩個數量級差異，也可以準確測定結晶紫和尼羅藍的濃度。從每種混合物的三次重復測量計算出的標準偏差也與泊松統計一致。這些結果表明，只要分析物濃度滿足單分子要求，即足夠低，dCERS就可以僅根據多種目標分析物在寬濃度范圍內的特征 SERS 特征來實現同時定量。作者通過通過檢查溶液中的微量百草枯進一步測試了 dCERS 的檢測能力，通過測試溶解在湖水中的百草枯證實了此類測量可以在類似于現場情況的復雜且無特征的背景下實現準確定量。作為其有效性的最終證明，作者還應用dCERS來檢測殺菌劑福美雙，證明了dCERS在檢測極低濃度的可溶性靶分子方面具有無與倫比的優勢。
展望
總之，該研究表明基于單分子計數的 dCERS 是一種有效且高效的超低濃度分子定量技術，只要目標分子表現出明確的、特定的光譜特征以及與熱點的充分相互作用，就可以僅僅基于目標分子的固有振動特征進行分子定量。前所未有的靈敏度和可預測的準確性使 dCERS 成為一種強大的、甚至可能是高要求應用的首選技術，包括環境保護、食品安全和誘變劑檢測。Bi, X., Czajkowsky, D.M., Shao, Z. et al. Digital colloid-enhanced Raman spectroscopy by single-molecule counting. Nature (2024).https://doi.org/10.1038/s41586-024-07218-1
