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在自然進化過程中，生物體通過利用簡單的原材料和優化其功能特性，制定了復雜的策略來適應惡劣的環境。其中一種策略是在生物材料的組裝中加入功能梯度，這涉及到局部化學成分、建筑單元的排列和材料內的分布的變化。這些梯度可以在生物材料的不同長度尺度上觀察到。然而，在人工自組裝系統中，實現對梯度的精確控制仍然是一項艱巨的任務。

這種生物材料的人工制造通常需要梯度界面的工程，這可能是一項具有挑戰性的工作。特別是，溶劑在許多自組裝系統中產生這種梯度方面起著關鍵作用。通過調節溶劑和組件部件之間的相互作用，可以形成一系列納米尺寸的結構，如顆粒、纖維、薄膜或囊泡。這些組裝過程通常表現出動態和非平衡特性。盡管它們很重要，但這些組裝過程背后的機制往往沒有得到很好的理解。納米沉淀是一種常見的溶劑介導的組裝技術，它利用混合溶劑來引導基于沉淀的自組裝，從而產生聚合物納米顆粒。該技術包括向聚合物溶液中添加過量的不良溶劑，通過沉淀觸發固體聚合物納米顆粒的形成。

鑒于此，新加坡南洋理工大學俞璟、高華健院士、中國農業科學院楊青、大連理工大學劉田等人描述了一種在仿生功能自組裝肽的設計中利用濃度梯度介導的自組裝的創新策略。仿生肽可以在不需要任何外部模板的情況下形成中空納米膠囊結構，并將基于肽的納米膠囊設計成一種多功能的遞送平臺，在各種生物醫學領域具有潛在的應用，如藥物遞送、免疫療法和基因治療。

昆蟲表皮肽的篩選

本研究首先對Ostrinia furnacalis昆蟲的頭部表皮進行了蛋白質組學分析，通過這種無標記定量的方法，我們鑒定了233種硬殼蛋白。這些蛋白質在昆蟲的不同生長階段表達顯著變化，表明它們在昆蟲表皮的形成中扮演著關鍵角色。進一步的分析中，我們專注于那些具有三個或以上重復單元的肽序列，這些序列至少包含五個氨基酸殘基。通過這一篩選標準，我們從昆蟲表皮蛋白中鑒定出九種具有重復序列的肽，它們因其保守的氨基酸組成和特定的序列重復模式，被認為具有形成納米結構的潛力。

圖|納米膠囊形成肽的從頭測序和篩選

溶劑誘導昆蟲表皮肽的自組裝

在探索這些昆蟲表皮肽的自組裝行為時，研究人員采用了溶劑誘導的納米沉淀技術。實驗中，觀察到五種肽（GL33, SF32, AP36, GH42, 和 YK34）由于在水和丙酮中的溶解性問題，未能形成穩定的組裝結構。而另外四種肽（WA30, NS36, VV30, 和 QH33）則成功形成了納米結構，特別是WA30和NS36，它們能夠形成中空的納米膠囊結構。這些結果表明，昆蟲表皮肽的自組裝能力高度依賴于它們的氨基酸序列和溶劑條件，其中水和丙酮的混合溶劑在形成濃度梯度中起到了關鍵作用。

圖|ICPs在水-丙酮混合溶劑中的組裝

ICP膠囊的組裝由微滴介導

自組裝過程涉及兩個不同的時間尺度：首先是形成肽豐富的微滴，隨后是微滴向更固態結構的轉變。通過光學和熒光顯微鏡成像，研究者觀察到微滴尺寸在數百秒內不斷增加，這是由于微滴的合并。此外，通過熒光恢復后光漂白（FRAP）實驗，研究者發現微滴表現出流體狀態，而成熟的納米膠囊則顯示出凝膠狀態，這表明在自組裝過程中，肽從液態向凝膠態轉變。

圖|自組裝過程中ICP二級結構的轉變

β-折疊的形成促進了ICPs的組裝

通過圓二色譜（CD）和衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）分析，研究者發現形成納米膠囊的肽在溶液中顯示出α-螺旋和β-轉角結構，而在形成膠囊時則轉變為β-折疊結構。這一轉變是通過硫黃素T（ThT）染色的熒光強度增加來監測的，ThT染色的增強熒光表明膠囊壁中存在交叉β-折疊結構。

揭示ICP自組裝的驅動力

分子動力學模擬和自由能擾動模擬揭示了肽與溶劑之間的相互作用以及在梯度界面上的能效。模擬結果表明，隨著丙酮濃度的增加，肽與溶劑之間的氫鍵減少，這可能導致肽向水濃度更高的區域遷移，從而促進納米膠囊的形成。此外，計算得到的轉移自由能（TFE）顯示，納米膠囊形成肽在水和丙酮之間的濃度存在能量最小值，這為肽在梯度界面的定位提供了驅動力。

圖|通過MD模擬探索ICP自組裝的驅動力

基于ICP納米膠囊的藥物胞漿遞送

研究者測試了納米膠囊裝載和釋放不同類型藥物的能力。實驗結果表明，納米膠囊對親水性大分子藥物如蛋白質和核酸具有高裝載效率，而對疏水性小分子藥物的裝載效率則取決于肽序列。此外，納米膠囊在模擬體內環境中能夠快速釋放藥物，這表明它們可能適用于靶向治療和藥物遞送。

圖|通過ICP膠囊封裝蛋白質和藥物

細胞實驗結果進一步證實了納米膠囊在藥物遞送中的潛力。通過共聚焦顯微鏡技術，研究者觀察到納米膠囊能夠成功進入HeLa細胞，并且具有較低的細胞毒性。此外，納米膠囊能夠有效地釋放裝載的親水性藥物如多柔比星（doxorubicin, DoX），并在細胞內共定位熒光標記的蛋白質，這表明納米膠囊能夠用于共遞送不同類型的藥物。

圖|使用ICPs納米膠囊將細胞內藥物、蛋白質和信使核糖核酸遞送到細胞中

小結

本研究通過深入探索昆蟲表皮肽的自組裝行為，揭示了溶劑濃度梯度在納米膠囊形成中的關鍵作用。研究者不僅觀察到了自組裝過程，還通過計算模擬深入理解了這一過程的分子機制。此外，納米膠囊在藥物裝載和細胞實驗中展現出的特性，表明了其在藥物遞送系統中的巨大潛力。這項研究不僅為生物材料的自組裝提供了新的見解，也為設計新型藥物遞送系統提供了有價值的策略。

參考文獻：

Li, H., Qian, X., Mohanram, H. et al. Self-assembly of peptide nanocapsules by a solvent concentration gradient. Nat. Nanotechnol. (2024).

https://doi.org/10.1038/s41565-024-01654-w