現有的疫苗接種策略已成功減少 SARS-CoV-2 (SARS2) 造成的死亡和嚴重疾病。然而，疫苗保護作用的減弱、新變種的不斷出現以及治療效果的不確定意味著仍然迫切需要新的疫苗策略。防范冠狀病毒帶來的新的大流行威脅也很重要，冠狀病毒此前曾導致 SARS-CoV (SARS1) 和 MERS-CoV的爆發。其他人畜共患冠狀病毒如 WIV1 和 SHC014 已被確定具有大流行潛力。使用單一抗原進行免疫通常會誘導狹窄的菌株特異性免疫反應，這可能無法抵御多種先前存在的菌株或該病原體新出現的變種。
在最近的研究中，VLP在其表面上展示一組隨機排列的蛋白質變體，以驅動B細胞的擴增，識別不同抗原的共同特征。鐵蛋白納米顆粒上不同血凝素頭的鑲嵌體引發了針對H1亞型內不同流感病毒株的交叉反應抗體。這種方法已應用于SARS2，鑲嵌納米粒子展示來自不同 sarbecovirus 的刺突的多個受體結合域（RBD）。Sarbecoviruses 是 beta 冠狀病毒的亞屬，包括 SARS1 和 SARS2。RBD可以通過基因融合或異肽偶聯在VLP上多聚化。一組 sarbecovirus RBD 與 SpyTag003 的融合有助于在 SpyCatcher003-mi3 VLP12 上進行簡單的納米組裝（圖 1a）。SpyCatcher003 是研究人員設計的一種蛋白質，可與 SpyTag 肽快速形成異肽鍵。mi3 是一種 60 聚體的中空蛋白質納米籠，經過計算設計可自組裝成穩定的十二面體。
先前，加州理工學院Pamela J. Bjorkman等人前后在2篇Science上表明，最廣泛的免疫反應來自顯示八種不同 RBD 的鑲嵌顆粒。這些 Mosaic-8 納米顆粒在小鼠和恒河猴模型中引發了針對多種sarbecovirus的中和抗體。重要的是，反應并不限于RBD表現在Mosaic-8納米顆粒上的病毒，還包括針對異源sarbeco病毒的不匹配反應。Mosaic-8納米粒子已獲得流行病防范創新聯盟的支持進入臨床試驗。然而，需要在良好制造規范級別生產九種不同的組件（八種 RBD 和 SpyCatcher003-mi3），這給廣泛擴展帶來了挑戰。
成果簡介
鑒于此，Pamela J. Bjorkman聯合牛津大學Mark R. Howarth和Alain R. Townsend等研究人員建立了多病毒四重納米籠（Quartet Nanocages）的生產（圖1a）。最初，研究人員用四種不同病毒的 RBD 表達多病毒四重體，連接成一條多肽鏈。這些抗原四重體通過終端 SpyTag 組裝，從 SpyCatcher003-mi3 納米籠中延伸出來，形成具有分支形態的蛋白質納米顆粒。這種納米組裝路線減少了疫苗成分的數量，并創建了一種允許在每個納米籠上展示更多數量的 RBD 的架構。抗體誘導的規模和廣度表明，Quartet 納米籠 可以提供一種可擴展的途徑來誘導一系列相關病毒的中和抗體，為新出現的疾病爆發威脅做好準備。
多病毒Quartet納米籠的設計
SARS-CoV-2的RBD是病毒與人體細胞表面血管緊張素轉換酶2（ACE2）結合的關鍵部分，也是大多數中和抗體的作用目標。研究者將四種與SARS-CoV-2在進化上有關聯的sarbecoviruses（SHC014、Rs4081、RaTG13和SARS2 Wuhan）的RBD通過基因融合技術結合在一起，制造了一個含有多種病毒抗原的復合體（稱為“Quartet”）。這個多病毒Quartet的設計允許與之前描述的Mosaic-4疫苗進行比較。為了實現在SpyCatcher003-mi3納米顆粒上的多價展示，研究者為Quartet設計了一個用于哺乳動物細胞分泌的信號序列和一個末端SpyTag。通過SpySwitch系統，Expi293F細胞有效地分泌并純化了Quartet。Quartet在SDS-PAGE上的條帶較寬，這是因為天然糖基化的變化所致。使用肽N-糖苷酶F（PNGase F）去除N-連接的糖基后，條帶位置向下移動。Quartet-SpyTag在尺寸排除色譜中顯示出均勻的峰。研究者證實了Quartet與SpyCatcher003-mi3的有效偶聯。
圖|多病毒Quartet納米籠的制備
Quartet 納米籠可提高針對多種sarbecovirus 的抗體
研究者評估了Quartet納米籠作為免疫原的能力，通過ELISA測試了小鼠免疫后的IgG抗體滴度。Quartet納米籠在初次免疫后對SARS2武漢RBD產生了最高的抗體反應，并且在增強免疫后保持了對SARS2的強免疫反應。此外，Quartet納米籠還能有效誘導對非免疫原RBDs的交叉反應性抗體。研究結果表明，Quartet納米籠可能具有對抗多種sarbecoviruses的廣泛保護潛力。此外，研究者發現RBD在Quartet鏈上的位置與抗體滴度之間沒有明顯關聯。
圖| Quartet納米籠免疫產生的廣泛免疫反應
Quartet 納米籠和Mosaic納米顆粒的比較
研究者將新型的Quartet納米籠疫苗與現有的Mosaic納米粒子疫苗進行了比較，后者具有隨機排列的RBDs。他們還創建了一種新的Quartet，包含不同的sarbecoviruses RBDs，并將其與SpyCatcher003-mi3結合，形成Dual Quartet 納米籠，以展示與Mosaic-8相同的多種RBDs。
實驗結果表明，Quartet 納米籠和Dual Quartet 納米籠在提高抗體滴度方面效果顯著，且對某些未包含在疫苗中的RBDs也有免疫反應。Mosaic-4和Mosaic-8疫苗相比SARS2同型納米籠，對sarbecoviruses RBDs產生了更高的抗體滴度。此外，研究者發現RBD在納米籠上的位置并不影響免疫反應的強度。所有疫苗成分（除了未偶聯的四聚體）都誘導了對SpyCatcher003-mi3的相似抗體反應，而SpyTag-MBP作為陰性對照，顯示出極少的抗體反應。
圖|Mosaic或Quartet納米籠免疫效果的比較
Quartet 納米籠誘導中和抗體
研究者測試了Quartet納米籠對SARS-CoV-2和Delta變種的中和能力，發現Quartet納米籠在誘導中和反應方面優于其他免疫原。Dual Quartet 納米籠在中和SARS1偽病毒方面表現最佳，而Quartet 納米籠和Mosaic-8也展現了較強的中和能力。為了增強免疫效果，研究者還使用了更高劑量的抗原和AddaVax佐劑。此外，研究者開發了包含SARS2 XBB.1.5的Kraken Quartet，以對抗新興的抗體逃逸變種。實驗結果顯示，Quartet和Mosaic免疫原在誘導對多種SARS2 VOCs的抗體結合方面效果相似，而含有XBB.1.5的免疫原對XBB.1.5偽病毒的中和能力顯著提高。這些發現證明了Quartet納米籠平臺能夠適應并保護免受新出現的病毒變種的影響。
圖| Quartet免疫原誘導的中和作用
對具有現有免疫力的小鼠進行Quartet 納米籠免疫
考慮到全球大多數人已經接種了SARS-CoV-2疫苗或曾經感染過，研究者探索了在已有免疫反應的情況下，是否能夠通過增強免疫激發廣泛的抗體反應。他們首先使用SARS-CoV-2武漢株的Spike蛋白進行初次免疫，然后使用設計用來引發廣泛免疫反應的Quartet 納米籠進行增強免疫。出乎意料的是，即使在不含SARS-CoV-2序列的Quartet [SARS1]中，增強免疫后對SARS-CoV-2的抗體反應仍然類似。此外，Quartet 納米籠和Mosaic-8免疫原在誘導對SARS1和BtKY72的抗體反應方面表現更佳。研究結果表明，Quartet納米籠能夠在已有特定病毒抗原偏見的情況下，誘導出廣泛的抗sarbecoviruses反應，并且即使缺少SARS2組分，也能激發對SARS2的抗體反應，同時對多種sarbecoviruses產生廣泛反應。
圖|Quartet疫苗誘導廣泛抗體，即使在預啟動的SARS-CoV-2反應后也是如此
Quartet 納米籠免疫原的進一步表征
研究者通過ELISA實驗探究了不同位置的RBDs對抗體結合的影響，發現抗體結合能力與RBDs在納米籠上的位置無關。為了驗證靈活連接子對展示多RBDs的影響，他們制備了無連接子的Quartet納米籠，并與常規Quartet納米籠進行了比較，結果表明連接子的存在與否并不影響免疫反應。此外，通過酵母展示深度突變掃描技術，研究者分析了SARS2武漢株RBD逃避抗體結合的突變，發現Quartet納米籠能夠激發針對不同類別抗體的反應，而Dual Quartet 納米籠和Mosaic-8免疫原主要激發對保守區域的抗體反應。這些發現有助于理解Quartet納米籠如何激發廣泛的免疫反應，即使在已有免疫偏見的情況下。
小結：
該研究成功開發了一種新型的Quartet納米籠疫苗平臺，能夠高效表達并展示多種病毒的RBDs，從而誘導產生對廣泛sarbecovirus的中和抗體。研究發現，即使在已有免疫偏見的個體中，Quartet納米籠也能激發廣泛的抗體反應，且其免疫原性不受RBDs在納米籠上位置的影響。與傳統的Mosaic-8疫苗相比，Quartet納米籠雖然只包含少數組分，但能誘導至少相當甚至更強的免疫反應。此外，即使面對能夠逃避現有抗體的Omicron變種，含有Omicron RBD的Quartet納米籠依然能誘導出有效的中和抗體。研究還表明，Quartet納米籠疫苗在增強免疫時能夠有效地擴大對多種sarbecovirus RBDs的免疫反應，這對于開發能夠應對未來病毒變種的疫苗具有重要意義。盡管研究存在一定的局限性，如僅在小鼠模型中進行，但Quartet納米籠的發現為設計更有效的疫苗平臺提供了有價值的信息，并可能推動預防性疫苗學的發展。
參考文獻：
Hills, R.A., Tan, T.K., Cohen, A.A. et al. Proactive vaccination using multiviral Quartet 納米籠 to elicit broad anti-coronavirus responses. Nat. Nanotechnol. (2024).
https://doi.org/10.1038/s41565-024-01655-9
